RHBDD1是本科室从睾丸抑制性消减杂交文库中筛选出的一个在睾丸组织中高表达的新基因。本基因在人中表达全长为315aa,其1—24aa预测为一个可以被切割的信号肽序列,可能参与介导蛋白的定位,本蛋白含有四个跨膜结构域,在其215—315aa之间为一段高度亲水性的区域。蛋白结构域分析表明,在其61-214aa含有一个高度保守的Rhomboid结构域,故本蛋白属于Rhomboid蛋白酶家族。　　 首先,利用从临床肿瘤中获得的乳腺癌和结直肠癌样品中,免疫印迹分析发现RHBDD1在肿瘤组织中有明显的高表达,而且在乳腺癌样品中发蚬RHBDD1的表达和肿瘤的恶性程度存在一定的关联:在恶性程度高的肿瘤样品中RHBDD1存在最高表达,中度恶性肿瘤样品表达较低,低恶性肿瘤样品表达最低。在结直肠癌细胞系HCT116中利用RHBDD1 RNAi慢病毒干扰内源性RHBDD1的表达发现,RHBDD1干扰之后细胞的增值速率明显降低,细胞集落形成能力明显降低并且细胞周期在G1/S检验点存在明显的阻遏。利用荧光素酶报告基因实验发现RHBDD1可以特异性地激活AP-1荧光素酶报告基因载体,而其RHBDD1S144A酶活性缺失突变体则没有激活活性。　　 酵母双杂交实验结果发现,RHBDD1可能与促凋亡蛋白TSAP6存在相互作用,免疫共沉淀实验也进一步证明了这两个蛋白质之间的相互作用。TSAP6是一个含488aa的参与细胞分泌和凋亡的蛋白,含有6个跨膜结构域,免疫印迹检测为55-70KD的双带型蛋白,文献报道其分子量较大的条带为糖基化修饰的蛋白。在两者共转染293T细胞条件下,发现TSAP6的55-70KD条带出现减弱,并且在38KD出现一个新的蛋白条带。由于RHBDD1是蛋白酶,故推测TSAP6可能为RHBDD1的底物蛋白。两者共转染TSAP6上面的双带出现减弱,并且出现38KD的条带,而共转染TSAP6和RHBDD1-S144A则无切割。TSAP6条带的切割也随RHBDD1剂量的增加而增加。　　 实验发现RHBDD1对TSAP6有至少三个切割位点,分别对应于TSAP6的第一、第二和第三跨膜结构域,并且其切割受切割位点附近氨基酸保守性的影响。免疫荧光实验结果显示,RHBDD1主要定位于细胞膜,少量存在于胞浆内,而TSAP6主要定位于胞浆中,两者共定位存在一定的位置关联性。采用宋伟博士利用细胞系Knock-in技术制作的内源性RHBDD1 G142A—S144A突变的HCT116细胞系(RHBDD1-mt)进行实验表明,RHBDD1-mt细胞的exosome分泌有明显的升高。并且,在RHBDD1-mt细胞分泌的exosme中exosome标志蛋白Tsg101和Tf-R也有明显的升高。利用蔗糖密度梯度超速离心实验验证exosome组分表明,Tsg101和Tf-R确实位于exosme之中。同时,RHBDD1-mt细胞所分泌的exosome样品中FasL和Trail分子的量也有升高,并可以促进这些exosome诱导Jurkat细胞凋亡的能力。这些工作充分说明了RHBDD1可以通过切割TSAP6调节exosome的分泌,从而影响exosome介导的生物学功能,影响机体的免疫调节。　　 此外,从德国GGTC中心购置了RHBDD1 gene-Trap小鼠胚胎干细胞系A049C04和W087D06,并委托中国医学科学院实验动物研究所张连峰教授课题组制作了RHBDD1 gene-Trap小鼠。A049C04获得了gene-Trap小鼠,W087D06干细胞制作gene-Trap未成功。生理观察和HE染色未发现A049C04制作的gene-trap小鼠有生理异常。采用X-gal染色小鼠组织冰冻切片发现,RHBDD1在多种组织中具有广泛的表达。在脑组织中,RHBDD1在小脑皮层蒲倾野氏细胞中有特异性高表达,并且在大脑神经元细胞中有广泛表达。在小肠绒毛上皮中,RHBDD1特异性地在小肠绒毛的基底细胞中特异性高表达。在睾丸组织中,RHBDD1在间质细胞中有异常的高表达,在精原细胞中也有高表达,精母细胞和各类精子细胞中表达量低。　　 此外,在原核细胞中表达His标签标记的RHBDD1215-315aa和TSAP61-126aa蛋白片段,通过镍柱和凝胶纯化获得了高纯度的抗原蛋白,并送交制作RHBDD1和TSAP6的单克隆抗体。我们利用免疫印迹实验进行单克隆杂交瘤细胞株的验证,得到了RHBDD1高度特异性的抗体杂交瘤细胞株以及TSAP6单克隆抗体杂交瘤细胞株,为后续更好地对RHBDD1进行功能研究提供了有力的支持。