第一章Co（0、1、2.5、5、10）支架的制备、表征及细胞毒性检测目的:制备不同掺钴量CLP多孔生物陶瓷支架Co（0、1、2.5、5、10）,研究不同掺钴量对CLP结构、物理特性及化学特性影响,检测五种支架细胞毒性进行生物相容性的初步筛查。方法:（1）利用固相烧结法合成不同掺钴量的生物陶瓷粉体,使其满足Ca（10-x）CoxLi（PO4）7（x=0、0.1、0.25、0.50、1）;利用三维打印技术（SE-3DP）制备多孔生物陶瓷支架Co0、Co1、Co2.5、Co5、Co10;（2）通过XRD检测、Raman检测和SEM观察对Co（0、1、2.5、5、10）支架进行表征;（3）万能实验机进行Co（0、1、2.5、5、10）支架的抗压强度测试;（4）SEM和XRD分析Co（0、1、2.5、5、10）支架浸泡入模拟体液后的体外矿化性能;（5）对比Co（0、1、2.5、5、10）支架浸泡入Tris-HCL前后质量和Tris-HCL溶液pH值变化评价支架的体外降解性能;（6）MTT法检测Co（0、1、2.5、5、10）支架的细胞毒性。结果:（1）钴掺杂使CLP的颜色由白色变为紫色。当钴掺杂量为1 mol%时,Co10支架颜色发生明显的突变;（2）XRD分析示:随着钴离子掺杂量的增加,CLP特征衍射峰逐渐向右发生了整体偏移;Raman光谱分析示,随着钴离子掺杂量的增加,Raman偏移向右移动,晶格常数变小;SEM观察示:Co（0、1、2.5、5）支架表面的晶粒大小随着钴离子掺杂量的增加而逐渐变小,而Co10支架表面没有晶粒形貌出现,出现了微裂纹;（3）随着钴离子掺杂量的增加,Co（0、1、2.5、5、10）支架的抗压强度呈现出逐渐降低的趋势,当钴离子掺杂浓度为1 mol%时,Co10支架抗压强度急剧降低,与Co（0、1、2.5、5）支架相比,差异有统计学意义（P<0.05）;（4）Co（0、1、2.5、5）支架在体外都发生了矿化,XRD检测示羟基磷灰石相,而Co10支架未发生矿化;（5）随着钴掺杂量的增加,Co（0、1、2.5、5、10）支架的失重总体成上升趋势;各组Tris-HCL溶液pH值随着降解时间的延长,总体表现为增长趋势;（6）Co（0、1、2.5、5）支架对L929细胞无毒性,而Co10支架对L929细胞有明显的细胞毒性。结论:（1）Co2+成功的掺杂进入CLP晶体结构中,取代了部分Ca2+。Co2+的掺杂对CLP结构带来明显影响,掺杂量越大,影响越明显,尤其钴掺杂量为1 mol%时,Co10支架结构发生明显突变;（2）Co（1、2.5、5）支架的抗压强度虽然有所降低,但仍在人类骨小梁抗压强度范围内,可以承受外部压力,抵抗断裂;（3）Co（0、1、2.5、5、10）支架体外都可以发生一定程度的降解;（4）Co（0、1、2.5、5）支架体外发生矿化,而Co10支架体外未发生矿化;（5）Co（0、1、2.5、5）支架无细胞毒性,而Co10支架有细胞毒性。第二章Co（0、1、2.5、5）支架生物相容性的研究目的:研究Co（0、1、2.5、5）支架及浸提液对rBMSCs粘附、增殖的影响。方法:（1）采用全骨髓贴壁法分离、培养SD大鼠原代BMSCs,并传代培养,通过细胞形态观察、细胞表面分子CD44、CD45、CD20和CD90流式检测及多向分化对所提取的原代BMSCs进行鉴定;（2）制备Co（0、1、2.5、5、10）浸提液,ICP-OES检测各组浸提液中离子组成及浓度;（3）Co（0、1、2.5、5）浸提液与rBMSCs共培养,在预设时间点行CCK-8检测和活/死细胞染色检测;（4）Co（0、1、2.5、5）支架与rBMSCs共培养,在预设时间点行CCK-8检测、SEM和CLSM检测。结果:（1）P0-P7 rBMSCs呈长梭形、成纤维样细胞形态,细胞排列呈“旋涡”状,P7rBMSCs细胞形态未见明显改变,仍保持良好的生长状态。细胞表面分子CD29、CD90、CD44和CD45经流式细胞仪检测阳性率依次为99.77%、99.36%、99.77%、0.88%。rBMSCs经体外成骨诱导后ALP染色、茜素红染色阳性,经成脂诱导后,油红O染色阳性;（2）Co（0、1、2.5、5、10）浸提液分析:Co（1、2.5、5、10）浸提液中都释放了一定量的Co2+,且Co2+的释放量随着Co2+掺杂量的增加而增加,而Co0浸提中未检测到Co2+。此外,Co（0、1、2.5、5、10）浸提液中都保持相对稳定的Ca2+和Li+释放量。（3）随着培养时间的延长,各组浸提液均可促进rBMSCs的增殖,其中Co2.5浸提液促rBMSCs增殖趋势显著,而Co5组在每个时间点其增殖趋势均低于Co（0、1、2.5）组,差异有统计学意义（P<0.05）。Co（0、1、2.5、5）在各个时间点以绿色活细胞为主,而红色死细胞数量极少。随着Co（0、1、2.5、5）浸提液培养rBMSCs时间的延长,各组死细胞视野稍增多,Co5组最多;（4）随着培养时间的延长,各组支架均可促进rBMSCs的增殖,在共培养5 d和7 d时,Co（0、1、2.5、5）四种支架中,Co2.5支架促rBMSCs增殖显著,与Co（0、1）支架表面的细胞形态无明显差异,呈典型的成纤维状,丝状伪足丰富,而Co5支架表面rBMSCs细胞数量相对较少,伸出伪足少;CLSM观察示:rBMSCs在Co（0、1、2.5、5）支架上细胞形态规则,呈典型的长梭形,胞体伸展,伸出长短不一的伪足与周围邻近细胞相连。结论:（1）采用全骨髓贴壁法成功分离、培养出了rBMSCs;（2）随着共培养时间的延长,Co2.5浸提液及支架显著促进了rBMSCs粘附、伸展及增殖,显示出良好的生物相容性。第三章Co（0、1、2.5、5）支架体外促成骨性能的研究目的:探讨Co（0、1、2.5、5）支架促rBMSCs成骨分化的能力。方法:（1）制备培养rBMSCs的Co（0、1、2.5、5）浸提液;（2）在不同预设时间点通过ALP染色和ALP活性检测,茜素红染色和钙含量检测,western blot检测ALP、BMP-2、RUNX2及OCN成骨分化相关蛋白的相对表达水平,评估Co（0、1、2.5、5）支架促rBMSCs成骨分化能力。结果:（1）Co（0、1、2.5、5）各组浸提液诱导rBMSCs 7 d时,各组细胞均被染成深蓝色。随着各组浸提液诱导时间延长,各组在第14 d的ALP染色强度要显著高于第7 d,呈蓝黑色,其中,Co2.5组的染色强度明显强于其他组;诱导7d时,Co（0、1、2.5、5）各组ALP活性均低于OM组,差异有统计学意义（P<0.05）,诱导14 d后,Co2.5组ALP活性显著增加,与其它组相比差异有统计学意义（P<0.05）;（2）在诱导21 d后,Co（0、1、2.5、5）各组浸提液均可见较多的红色或橘红色钙化结节形成。Co2.5组的钙含量要显著高于Co（0、1、5）组,差异有统计学意义（P<0.05）,稍低于OM组的钙含量,两者之间差异无统计学意义（P>0.05）;（3）在诱导14 d时,Co2.5组ALP蛋白和BMP-2蛋白的表达量最高,与Co（0、1、5）组相比差异有统计学意义（P<0.05）。虽然不同掺钴水平组间OCN表达差异不显著,但Co2.5组OCN蛋白表达显著高于Co0组,差异有统计学意义（P<0.05）。RUNX2蛋白在Co2.5组表达量高于Co（0、5）组,略低于Co1组,但两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:Co（0、1、2.5、5）浸提液均可促进rBMSCs成骨分化、分泌细胞外基质,并使分泌的细胞外基质发生钙化,Co2.5组促rBMSCs成骨分化性能最优。第四章Co（0、1、2.5、5）支架体外诱导血管形成性能的研究目的:探讨Co（0、1、2.5、5）支架模拟低氧环境的生物学功能及促进HUVECs增殖和成管效果。方法:（1）制备培养HUVECs的浸提液;（2）CCK-8法检测Co（0、1、2.5、5）浸提液对HUVECs增殖的影响;（3）体外成管实验检测Co（0、1、2.5、5）浸提液促HUVECs迁移、成管的效果;（4）Western blot检测Co（0、1、2.5、5）浸提液对HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达水平的影响。结果:（1）随着培养时间的延长,Co（0、1、2.5、5）浸提液均可促进HUVECs的增殖,培养7d时,Co2.5组显著的促进了HUVECs增殖,紧接着依次为Co1组,Co0组和Co5组,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Co2.5组比Co（0、1、5）组保持了较好的管状结构。从分支总长度和分支数量的定量分析可以看出,在每个时间点,Co（1、2.5、5）组的数值均高于Co组,尤其是Co2.5组,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）与Co0组相比,Co（1、2.5、5）组HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达量均显著上调,差异有统计学意义（P<0.05）。在Co（1、2.5、5）之间,Co2.5组显著提高了HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的表达量。结论:Co（0、1、2.5、5）浸提液均可促进HUVECs增殖、迁移及出芽形成血管样结构,Co2.5组比Co（0、1、5）组形成的血管样结构数目相对较多,结构形态完整;与Co0组相比,Co（1、2.5、5）稳定了rBMSCs表达HIF-1α蛋白水平,模拟低氧环境,进而上调VEGF蛋白表达,促进血管形成,其中Co2.5组诱导血管形成性能最优。第五章Co2.5支架修复颅骨缺损的研究目的:探讨Co2.5支架修复大鼠颅骨缺损的可行性,评价其体内促新骨生成和血管形成能力。方法:（1）18只SD大鼠制备单个直径5 mm颅骨缺损模型;随机分为三组:空白组、Co0组和Co2.5组,每组6个颅骨缺损（n=6）;术后8 w取颅骨标本;（2）通过大体观察颅骨缺损情况,micro-CT分析BV、TV和BMD,以及HE染色、Masson染色和免疫组化染色（Col-Ⅰ和CD31）评价Co2.5支架促进新骨生成及血管形成的程度。结果:（1）术后Co0组有1只SD大鼠因麻醉药过量致死,立即给予补足;所有SD大鼠的切口愈合良好,无红肿、渗出、流脓及皮肤破溃和坏死;（2）Micro-CT分析示:Co2.5组的BV/TV大于Co0组和空白组,组间差异有统计学意义（P<0.05）。各组BMD由高到低依次为Co2.5组、Co0组及空白组,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（3）HE染色分析示:各组新骨形成面积百分比由高到低依次为Co2.5组、Co0组以及空白组,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）;Masson染色示:在空白组缺损边缘可见少量未成熟新生骨组织,Co0组和Co2.5组以成熟的新生骨组织为主,并且Co2.5的新生骨量要明显多于Co0组;（4）CD31免疫组化分析示:Co0组和Co2.5组血管数目多于空白组,差异有统计学意义（P<0.05）;Co2.5组血管数多于Co0组,差异有统计学意义（P<0.05）;Col-Ⅰ免疫组化分析示:空白组Col-Ⅰ为阴性表达;Co0组Col-Ⅰ为阳性表达;Co2.5组Col-Ⅰ为强阳性表达。结论:Co2.5支架可显著促进体内新骨生成和血管形成,促进大鼠颅骨缺损骨修复的能力显著优于Co0支架和空白组。