Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是一种重要的免疫识别受体,在单核巨噬细胞,DC细胞等多种细胞中广泛表达,它识别布鲁氏菌在内的革兰氏阴性菌的LPS,引发炎症反应,在侵入病原体的感知与清除中发挥着重要作用。过表达oTLR4(ovis aries TLR4)的转基因绵羊在爆发布鲁氏菌病的疫区表现出良好的抗病潜力,因此本实验通过人工感染实验来验证过表达oTLR4转基因绵羊是否有更好的抗布鲁氏菌病的能力。通过PCR和Southern Blot方法,对来源于3只转基因公羊的F1代群体共计289只进行了过表达TLR4基因的检测,共鉴定出阳性绵羊119只,外源基因的遗传率为41.18%,转基因阳性绵羊TLR4 mRNA能够稳定高表达(平均比非转基因个体高出1.5倍)。根据遗传背景、品种、个体发育和转基因与否挑选20只转基因羊和20只非转基因羊,分成四个攻毒剂量组。利用结膜接种的方式感染布鲁氏菌16M,通过28天的综合检测来评估过表达oTLR4转基因绵羊在布鲁氏菌病急性期的抗病表现。结果低剂量(10~5和10~6CFU)和高剂量组(107,108CFU)间在急性期临床表现有较大的差别。低剂量组临床症状表现不明显,个别羊出现体温升高和白细胞增多;但高剂量组,攻毒后体温出现剧烈上升,运动量出现显著下降,WBC,淋巴细胞数等相关指标在第7天后出现显著增多,其中108剂量组在第14天检测到白细胞数和淋巴细胞数转基因组显著高于非转基因组。检测外周血单核细胞的细胞因子表达量,结果显示低剂量组在攻毒后0.5天、1天、2天、3天、7天,14天和28天所有时间点均无显著变化,而高剂量组中,炎症因子升高,其中108组,攻毒后7天和14天转基因组外周血单核巨噬细胞IL6、TNFα、IL1 α和IL1 β等炎症相关细胞因子的极显著高于非转基组,7天时趋化因子IL8也表现出转基因组的显著升高。结合肝脏,肾脏,脾脏和淋巴结等组织的病理切片,结果显示随着感染剂量的增加,实验羊的免疫反应逐渐增强,且转基因组的增强幅度大于非转基因组,在高剂量攻毒时带来了更严重的组织损伤。通过虎红检测和微量凝集实验,主要脏器和淋巴结的细菌分离,确定各组的感染情况,结果显示在10~5和10~6CFU攻毒剂量组,转基因组布鲁氏菌感染数(1/10)要少于非转基因组(3/10),通过比较载菌量和感染范围,10~5和10~6组转基因羊感染程度显著低于非转基因组。而在高剂量组中,转基因羊(8/10)布鲁氏菌感染数则要高于非转基因羊的感染数(7/10)。转基因组的感染程度要高于非转基因组。通过绵羊的单核巨噬细胞侵染实验,发现M0I50时侵染后1h转基因个体载菌量极显著高于非转基因个体,显示过表达TLR4提高了巨噬细胞对布鲁氏菌的吞噬能力。IFNg、IL6、TNFα、Nos2和IL1 β等炎症因子表达量极显著高于非转基因组,说明在感染过程中过表达TLR4提高了巨噬细胞的炎症反应程度。本研究验证了在低剂量侵染时,过表达oTLR4通过提高巨噬细胞吞噬能力和炎症反应程度增强了抵抗布鲁氏菌病的能力,而在高剂量侵染时,过表达TLR4导致更严重的组织损伤而加重了实验羊的感染程度。