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降血压肽(AHP)毒副作用低、降压效果明显、来源广泛,已成为目前研究的热点。
本课题组已成功构建基因工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP),并实现了重组降血压肽Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg(VLPVPR)的高效表达。本研究在此基础上探索该重组降血压肽的分离纯化工艺,并对其生物学活性进行了初步研究。主要研究内容和结果如下：
1.对重组降血压肽基因工程菌细胞采用反复冻融法和超声波破碎法分别进行了破碎研究。确定细胞破碎的最佳方法及条件为：每克湿菌体重悬于3 mL 1×PBS缓冲液,添加EDTA至终浓度2 mmol/L,溶菌酶至终浓度20000 U/mL,30℃放置30 min后超声破碎30 min,4℃12000 g离心10 min收集上清液。在此条件下,上清液中GST-AHP浓度为1.831g/L。
2.对胰蛋白酶水解工程菌表达产物制备VLPVPR进行了正交优化实验,确定最佳工艺条件为：酶解温度为37℃,pH 8.0,酶浓度为90 U/mL,酶解时间为4 h。在此条件下,酶解产物中VLPVPR浓度为211.1 mg/L,占干物质总质量的0.434％。
3.大孔吸附树脂HPD100B对VLPVPR具有较好的纯化分离能力,其最佳分离工艺条件为：上样液pH 9.8,上样量12 BV,上样流速3 mL/cm2·min,上样结束后用水和8％乙醇各洗涤4BV,流速均为1 mL/cm2·min,而后改用60％乙醇以0.25 mL/cm2·min洗脱3 BV。此工艺下VLPVPR的回收率为92.7％,纯度为28.8％,比纯化前提高了65倍。
4.VLPVPR体外对ACE具有较强的抑制活性,其IC50为4.1μmol/L。