副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）属于巴斯德科嗜血杆菌属,是没有运动性、具有NAD依赖性的革兰氏阴性菌,作为一种条件致病菌常定殖于猪上呼吸道。由副猪嗜血杆菌引起的格拉瑟氏病给养猪业的重大经济损失,主要影响在仔猪和早期育肥阶段。同铜绿假单胞菌一样,副猪嗜血杆菌具有在体外形成生物被膜的能力,且不同的副猪嗜血杆菌杆菌菌株之间形成的生物被膜能力不同。研究表明副猪嗜血杆菌生物被膜的形成与非毒株的定植密切相关,也有助于副猪嗜血杆菌产生耐药性,这给格拉瑟氏病的治疗带来了巨大挑战。目前国内外对于副猪嗜血杆菌生物被膜的研究主要集中在生物被膜的形成机制以及对宿主的抵抗力及耐性性增强方面,但是只考虑个别蛋白和基因,不足以为副猪嗜血杆菌生物被膜的深入研究提供足够的参考。为了探究副猪嗜血杆菌生物被膜的生物学特征,寻找其生物被膜形成相关基因,研究生物被膜形成的基因表达调节机制。本研究改进体外培养生物被膜模型,筛选出多株形成生物被膜能力强的副猪嗜血杆菌,测定生物被膜形成周期,测定酶消化生物被膜作用,观察生物被膜结构,同时在国内首次将RNA-seq技术应用于副猪嗜血杆菌生物被膜的研究,对副猪嗜血杆菌菌株HPS-W的生物被膜态菌和浮游态菌进行转录组测序分析,通过GO和KEGG富集分析探究差异表达基因所富集到的功能条目、生化代谢及信号转导途径。1.副猪嗜血杆菌生物被膜的测定及生物学特征研究本研究改进了通过细胞培养板体外培养生物被膜方法,从13株副猪嗜血杆菌杆菌中筛选出5株形成生物被膜能力强,4株形成生物被膜能力较弱。生物被膜形成量在前24 h内快速增长,在60 h趋于稳定。多株副猪嗜血杆菌杆菌的生物被膜对Proteinase K处理最敏感,对DNAseⅠ处理的敏感度次之,对Disperin B处理具有抗性。通过扫描电子显微镜观察HPS-W菌株培养72 h形成的生物被膜立体形态,结果显示副猪嗜血杆菌多呈短杆状,菌体黏附于介质表面,多个菌体粘结堆叠在一起,胞外多聚基质将堆叠的菌体包裹在其中而形成膜样细菌聚合物。2.基于RNA-seq技术分析副猪嗜血杆菌生物被膜形成相关基因以上文筛选出生物被膜形成能力最强的HPS-W菌株为研究对象,培养其生物被膜态菌（B1、B2、B3）和浮游态菌（F1、F2、F3）,采用RNA-seq测序技术检测两类样本的m RNA的转录情况。上机测序后去除含接头和低质量的reads数据,6个样本共得到高质量有效数据Clean bases共8.31 G,测序错误率均不超过0.3%,Q30均大于90%,GC含量较一致。有效数据Clean reads能够比对到参考基因组的平均比例为94.93%,比对到参考基因序列的平均比例86.18%。基因表达水平高,表达量在log10（FPKM+1）=2下的基因数量最多。基于基因表达水平分析计算出的readcount数据,按照qvalue≤0.05,|log2Fold Change|≥1,且FPKM≥1的标准筛选出被膜态菌相较于浮游态菌的差异表达基因共128个,有72个基因表达显著提高,56个基因表达显著降低。通过GO富集分析表明,差异基因主要涉及碳水化合物运输、生物蛋白质折叠、谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程等生物过程以及腺苷酸交换因子活性、蛋白质结合、结构特异性DNA结合等分子功能。KEGG pathway富集分析表明,差异基因富集到的通路主要涉及淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢、叶酸生物合成、ABC转运蛋白等通路。为了验证RNA-seq数据的可靠性,本研究采用q RT-PCR技术,以16Sr RNA基因作为内参,用2-ΔΔCt方法计算14个随机选择差异表达基因的表达量。验证结果显示,q RT-PCR中差异表达基因结果与RNA-seq数据中差异表达基因结果趋势基本一致,证明了RNA-seq数据的可靠性。