论文部分内容阅读
第一章携带抗CD40单链抗体的树突状细胞的肿瘤免疫治疗作用目的：抗CD40激活型抗体和IL-2的共同作用可以有效地促进免疫系统的抗肿瘤作用。这一治疗虽然能够有效地促进初次免疫应答，但它减弱了再次免疫应答。研究表明CD4~+T细胞的凋亡可能是影响CD8~+T细胞的记忆反应的原因。抗CD40激活型抗体的作用靶点是表达CD40的细胞，主要是具有抗原递呈作用的树突状细胞（DC）或巨噬细胞（Mφ）。激活的Mφ所分泌的IFN-γ可能是引起CD4~+T细胞凋亡的重要原因。本课题将首先证明抗CD40激活型抗体作用于DC和Mφ所产生的IFN-γ的不同及其对CD4~+T细胞增殖和凋亡的不同影响。为了降低激活的Mφ对CD8~+T细胞记忆反应的影响，将克隆抗CD40激活型抗体的单链抗体（scFv），并采用慢病毒感染的方法制备携带CD40scFv的DC。通过体内和体外实验，研究携带抗CD40scFv的DC的抗肿瘤作用。方法：（1） CD4~+T细胞和DC或Mφ共培养，用流式细胞术检测CD4~+T细胞的增殖和凋亡情况，以确定DC和Mφ激活后对CD4~+T细胞的不同影响及DC和Mφ激活后分泌IFN-γ的情况。（2）采用RT-PCR和重叠延伸PCR获得抗CD40激活型抗体的scFv基因，构建含有重组大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体的慢病毒穿梭质粒，并与其它包装质粒一起通过磷酸钙感染293T细胞，得到假病毒，用于感染DC。（3）从不同角度流式分析感染Venus空载体和携带抗CD40单链抗体的YFP阳性DC的激活程度，以确定携带抗CD40单链抗体的DC能被有效地激活。（4）通过体内实验检测携带抗CD40单链抗体的DC对肿瘤的免疫治疗作用。小鼠皮下注射EG.7细胞，将荷瘤小鼠分成5组，分别是PBS组，DC感染Venus空载体组，DC感染Venus-CD40-scFv组，DC感染Venus空载体并用OVA孵育过夜组，DC感染了Venus-CD40-scFv并用OVA孵育过夜组，通过测量肿瘤的生长情况评价携带抗CD40单链抗体的DC对肿瘤的免疫治疗效果。结果：（1）实验证明了DC和Mφ激活后对CD4+T细胞的不同影响，与Mφ比较，DC能够促进CD4+T细胞的增殖，并且分泌较少的IFN-γ。（2）成功克隆了大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的scFv,并制备了表达此scFv的慢病毒穿梭质粒，并与其他包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞，得到有效的慢病毒。（3）对比感染Venus空载体和携带抗CD40单链抗体的DC激活情况，说明携带抗CD40单链抗体的DC能够被有效地激活。（4）体内实验初步证明携带抗CD40单链抗体的DC能够有效抑制肿瘤的生长。结论：本研究表明激活的DC能够更有效地促进CD4+T细胞的增殖，并初步证明了携带抗CD40单链抗体的DC对肿瘤的免疫治疗有促进作用。第二章CD4~+T细胞表面CD40的表达及作用目的：CD40组成性表达在DC上，而很少表达在静息的T细胞上。有研究发现激活的CD4~+T细胞可以大量表达CD40。本课题将在体外培养体系中研究激活的CD4~+T细胞表面CD40的来源，及表达了CD40的CD4~+T的功能特点。另外，我们还将探讨激活的CD4~+T细胞表面的CD40分子是否在激活型抗CD40抗体的作用下传递激活信号。方法：（1）通过流式细胞术来检测CD4~+T细胞在单独培养、与DC共培养和在抗CD3和抗CD28刺激下与DC共培养等不同的条件下，其表面CD40的表达。（2） RT-PCR证明激活的CD4~+T细胞表面上的CD40是来自于共培养的DC，流式细胞术从不同角度检测CD4~+T细胞获得CD40后产生的CD4lowT细胞和CD4hiT细胞及CD40~+CD4~+T细胞和CD40-CD4~+T细胞的激活程度及其细胞记忆表型。（3）流式分选培养得到的CD40~+CD4~+T细胞和CD40-CD4~+T细胞，在抗CD40激活型抗体的刺激下，从增殖和凋亡两个方面来研究这两群细胞的功能。结果：（1）在没有DC存在的培养条件下，CD4~+T细胞只有少量的CD40的表达，而DC与激活的CD4~+T细胞共培养才能使CD4~+T细胞表面有大量的CD40表达，并且随着DC数量的增加而上升。PCR结果表明激活的CD4~+T细胞表面上的CD40是来自于共培养的DC。（2）在DC与激活的CD4~+T细胞共培养体系中产生的CD4lowT细胞和CD4hiT细胞的激活程度不同。CD4hiT细胞高表达CD40，并且随着DC数量的增加，CD4hiT细胞记忆表型的比例升高。（3）在DC与激活的CD4~+T细胞共培养体系中产生的CD40~+CD4~+T细胞CD40-CD4~+T细胞的激活程度不同。（4）流式分选在DC与激活的CD4~+T细胞共培养体系中产生的CD40~+CD4~+T细胞和CD40-CD4~+T细胞，于不同时间点检测发现CD40~+CD4~+T细胞增殖明显比CD40-CD4~+T细胞快，而且凋亡的比例也明显比CD40-CD4~+T细胞少，但激活型抗体并无进一步的激活作用。结论：激活的CD4~+T细胞能够获取共培养体系中DC的CD40，由此产生的CD40~+CD4hiT细胞呈激活和记忆表型，CD40~+CD4~+T细胞的增殖能力明显高于CD40-CD4~+T细胞，CD40~+CD4~+T细胞的凋亡比率也明显低于CD40-CD4~+T细胞。因而我们推断从DC上获得了CD40的CD4~+T细胞多呈活化表型，并具有较强的增殖和抗凋亡能力，然而其表面的CD40分子不再具有传递胞内激活信号的能力。