单分子检测技术是一个崭新发展的技术,具有单分子检测灵敏度。单分子检测技术具有灵敏度高、特异性好和样品消耗少的优点,已被广泛应用于生化分析、药物研发和疾病早期诊断领域。本论文中,我们基于单分子检测技术构建了两种生物传感器用于灵敏检测去甲基化酶FTO和蛋白Ago2。具体研究内容如下:1、我们开发了一种基于滚环转录（Rolling Circle Transcription,RCT）和CRISPR/Cas12a系统的方法结合单分子检测技术灵敏检测FTO。N6-甲基腺苷（N6-methyladenine,m6A）修饰是哺乳动物细胞中最常见的m RNA修饰,受到RNA去甲基化酶的动态可逆调节,例如脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）和烷基化修复同源蛋白5（ALKBH5）。RNA去甲基化酶的异常表达与许多人类疾病密切相关,包括人类肥胖和癌症。在本工作中,我们设计了含有特异性序列（5’-G-A-T-C-3’）的单链DNA（single-stranded DNA,ss DNA）作为底物,并在3’端修饰了生物素。当靶标FTO存在时,可识别底物ss DNA中的m6A并去除。磁性分离后,裂解的双链DNA（double-stranded DNA,ds DNA）底物可作为引物启动基于T7RNA聚合酶的RCT扩增,生成大量CRISPR RNA（cr RNA）。产物cr RNA又可引发由CRISPR/Cas12a系统催化的FAM荧光标记探针的裂解,释放大量FAM分子。释放的FAM分子可以通过基于全内反射荧光（total internal reflection fluorescence,TIRF）的单分子检测简单计数,通过检测FAM分子可以实现对FTO活性的准确定量。cr RNA引发FAM标记探针的裂解有效抑制了非特异性背景信号,磁性分离和单分子检测的引入进一步提高了该方法的灵敏度。该方法具有较高的特异性和灵敏度,检出限为1.20×10-13 M,甚至可以在单细胞水平检测FTO。该方法可以准确区分FTO在健康人和乳腺癌患者组织中的表达。它可用于潜在抑制剂的筛选,在临床诊断、生物医学研究和药物研发方面具有很大的潜力。2、我们开发了一种基于金纳米颗粒（Au NP）的单分子生物传感器,用于简单、灵敏地检测Ago2活性。Ago2是RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）的重要组成部分,参与多种生理过程,Ago2活性失调与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。已报道的Ago2测定方法通常存在操作繁琐、反应体系复杂和灵敏度低等缺点。在本工作中,我们通过在Au NP上自组装多个Cy5标记的信号探针构建了对Ago2特异响应的Au NP探针。在该探针中,Cy5荧光能够被Au NP有效猝灭。当存在靶标Ago2时,它与引导RNA（guide RNA,g RNA）结合形成活性RISC,RISC能够循环裂解信号探针,导致Cy5分子从Au NP探针释放。释放的Cy5分子可以通过单分子计数准确定量。该生物传感器无需任何抗体和蛋白酶的参与,仅利用单个Au NP探针就可以均相检测Ago2活性。该单分子生物传感器具有高特异性和灵敏度,检出限为9.10×10-12 M,可用于Ago2抑制剂的筛选、Ago2动力学分析和人体细胞内源性Ago2活性的测定,在Ago2相关的生物医学研究和临床诊断中具有广阔应用前景。