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结核病是最严重的传染性疾病之一,每年大约杀死2百万人,世界上1/3的人口是潜伏感染者。由于人口流动速度的增加导致结核病与AIDS共感染,不规范不合理地滥用抗生素导致多重耐药结核菌和广泛耐药结核菌的流行,使得近年来结核病预防工作遇到了瓶颈。2011年报道仅在欧洲就有15个多重耐药性的国家,致使欧洲结核病“卷土重来”,尤其是英国伦敦,每年新增病例中2%是多重耐药性结核病。目前临床上主要使用一线抗结核药物(异烟肼(Isoniazid)、利福平(Rifampicin)、乙胺丁醇(Ethambutol)和链霉素(straptomycin))治疗,但是随着医患工作中存在的问题如各种抗生素滥用,治疗时间漫长,物质和精神的双重折磨,导致多重耐药性和广泛耐药性结核病的出现,且所占比例不断地上升,引起了全球公共卫生治疗的高度重视。由于部分患者免疫系统受损,导致接种BCG的不安全,全球都在呼吁新型抗结核病药物和治疗性疫苗[1]。世卫组织决定在2015年前使结核病死亡人数和流行率减半,要想达到这个目标,除了需要政府强制性加强防范意识外,还亟需科研工作者更深入地了解结核分枝杆菌治病的机理。
结核分枝杆菌面对复杂多变的环境,需要通过各种途径来抵抗外界压力,保持自身的平衡,其中转录调控因子起着非常重要的作用。研究发现在特定环境下,如饥饿、氧化压力等,IclR转录调控因子对维持细菌生存起关键作用。IclR家族广泛地分布于各种细菌中,参与多种生物学功能,如初级和次级代谢、毒性、群体感应和芽孢。例如C.glutamicumIB1486突变体中亮氨酸和色氨酸的合成量都有增加[2],在PseudomonasputidattgV突变体中,外排泵ttgGHI操作子高表达[3],在Agrobacteriumtumefaciens中AttJ控制群体感应信号的开关[4]。在E.coli中,IclR通过Icl(isocitratelyase)控制碳源的利用。Icl是乙醛酸支路中的关键酶,实验验证它通过提高细菌在巨噬细胞的存活来维持持续性感染,并且由于哺乳动物缺乏乙醛酸循环途径,所以Icl可作为潜在的药物靶标[5]。MycobacteriumtuberculosisCDC1551中两个icl基因同时缺失,将导致胞内细菌复制减退且迅速从肺组织中清除。化学抑制剂3-nitropropionate(3-NP)抑制Icl1(aceA-1)和Icl2(aceA-2)活性,阻断了以脂肪酸作为碳源的培养基和巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长[6]。
潜伏期的结核分枝杆菌是导致结核病化疗疗程偏长,疗效不佳和化疗后再次复发的主要因素,也是结核病控制形势比较严峻的原因之一。结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬后进入持留状态,在此环境下可能极度缺乏葡萄糖和氨基酸等必要营养源,加之各种各样的抗菌物质和低pH环境等不利因素使结核菌的生存面临极大危机。此时结核分枝杆菌可利用脂肪酸作为唯一营养源,通过乙醛酸循环途径维持生存。M.tuberculosisH37Rv基因组中预测有三个IclR编码基因,分别为Rv2989,Rv1773c,Rvl719,它们的氨基酸相似性为14.7%,核苷酸相似性为26.3%,其中Rvl773c编码序列在Mycobacteriumbovis中有一段完全相同的编码序列。通过Tn5370转座子诱变的H37Rv菌株发现Rv1773c可能参与结核分枝杆菌的毒性调控,Rv1773c突变体比野生型菌株对严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠毒性更强,这可能解释为Rv1773c突变,Icl活性增强,使结核分枝杆菌在宿主体内更好地利用乙醛酸循环来维持生存[7]。因此探索结核分枝杆菌中IclR与Icl的关系,是否也存在类似精确的乙醛酸循环,具体调控机制如何,必然有助于认识结核分枝杆菌潜伏期躲避伤害,维持生存的机制。我们期望利用对其他致病菌中IclR家族成员的研究来分析结核分枝杆菌中IclR家族的功能,以更好地阐明结核分枝杆菌的致病机制,寻找治疗结核病提供新的方法。
为了研究结核分枝杆菌中Rv2989的基本功能,本文主要通过将MTBH37Rv的IclR家族成员Rv2989基因克隆到耻垢分枝杆菌中进行表达,研究其对宿主菌生长、抗氧化压力、生物膜形成以及亮氨酸合成等影响。从GenBank数据库中获得M.TuberculosisH37RvRv2989的核苷酸序列,利用PrimerPremier设计引物,提取MTBH37Rv基因组作为模板,体外扩增获得Rv2989基因。将Rv2989基因的PCR产物连接到pMD19-TSimpleVector,然后亚克隆至穿梭性质粒pNIT-myc中,经质粒抽提、菌落PCR验证、双酶切验证以及序列测序比对证明重组质粒pNIT-myc-Rv2989构建成功。将重组质粒电转到耻垢分枝杆菌,通过菌落PCR验证、双酶切验证、16SRNA验证以及测序表明pNIT-myc-Rv2989成功电转入耻垢分枝杆菌中,利用western-blot验证己内酰胺诱导表达重组蛋白。为了进一步了解Rv2989蛋白在生物体内的功能,我们研究了过表达Rv2989蛋白对宿主菌的影响,包括宿主菌生长、抗氧化压力和生物膜形成和亮氨酸合成。实验结果表明Rv2989过表达减缓宿主菌进入稳定期的速率:当过氧化氢浓度低时,Rv2989过表达增加抗氧化氢能力,但重组菌对生物膜形成和滑动能力没有明显的影响;Rv2989过表达诱导leuC表达。
随着结核分枝杆菌全基因组序列测定完成,科研工作者越来越关注这些大量未知基因的功能。为了更好地模拟体内的生长环境,受酵母双杂交系统的启发,AmitSingh等人利用分枝杆菌蛋白质相互作用(M-PFC)系统.来探索分枝杆菌中蛋白质间的相互作用[8]。M-PFC系统主要原理是甲氧苄啶是二氢叶酸还原酶的特异性抑制剂,但是该抗生素对细菌二氢叶酸还原酶的亲和性是哺乳动物二氢叶酸还原酶的约12000倍,即一定浓度的甲氧苄啶能抑制细菌二氢叶酸还原酶活性,但不会影响哺乳动物二氢叶酸还原酶活性。本文参照M-PFC实验方案,通过寻找与Rv2989相互作用的蛋白,构建网络,探索Rv2989的功能机制。我们通过PCR扩增出Rv2989基因片段,将Rv2989PCR产物连接到整合性质粒pUAB400质粒上,成功构建pUAB400-Rv2989重组质粒,并转化到耻垢分枝杆菌中。利用pUAB300质粒构建结核分枝杆菌H37RV基因组文库,并提取质粒电转到pUAB400-Rv2989重组耻垢分枝杆菌。通过pUAB400和pUAB300上所携带的蛋白质相互作用赋予细菌完整的哺乳动物二氢叶酸还原酶活性,以抵抗甲氧苄啶,筛选出与Rv2989相互作用的蛋白。实验结果表明该系统能在本实验室成功地应用,但暂时并没有找到与Rv2989相互作用的蛋白。对该结果分析可能是由于以下几个原因,1)文库的量远远不够,2)与Rv2989相互作用的蛋白不够紧密,作用时间短,3)Rv2989作为转录因子,在特定情况下才与其他蛋白相互作用。