目的:军团菌肺炎是社区环境中常见的三种重症肺炎之一,发病率2-9%,病死率10%,血清1型嗜肺军团菌(Lp)对人类最有致病力,占军团菌感染的84%。免疫抑制状态是军团菌感染的重要危险因素,而且免疫抑制宿主相较正常免疫力宿主更易感染Lp,更易发展成重症肺炎,病死率可达20-70%。重症肺炎特征性病理生理改变为肺毛细血管通透性增加、肺水肿。目前免疫抑制宿主感染Lp多为临床个案报道,缺乏与正常免疫力宿主感染Lp间病情严重程度差异的机制研究,同时,军团菌肺炎患者易出现多器官系统损伤,如肝功能异常、腹泻等等,多为临床个案报道,尚无相关基础研究。本研究建立免疫抑制合并Lp感染豚鼠模型,研究其平均肺动脉压变化、肺毛细血管通透性改变程度、肠道菌群失衡、肠道细菌易位及其导致的肝脏损伤等,以期解答部分临床问题。研究方法:本研究分二部分,第一部分研究免疫抑制合并Lp感染豚鼠肺毛细血管通透性改变机制及平均肺动脉在肺水肿形成过程中的作用。实验动物分为四组:对照组,Lp感染组,免疫抑制组及免疫抑制合并Lp感染组,三个实验时间点Lp感染24h、48h和72h。免疫抑制豚鼠通过注射曲安奈德及环磷酰胺获得,随后主气道接种Lp获得免疫抑制合并Lp感染豚鼠。首先检测各组24h、48h及72h外周血白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、CD4~+T细胞及CD8~+T细胞,确定免疫抑制造模成功;随后测量肺重量、离体肺重量变化情况,了解在体肺水肿情况、肺毛细血管通透性改变程度及平均肺动脉压在免疫抑制合并Lp感染豚鼠肺水肿形成中所起作用;最后进行肺组织HE染色、免疫组化、免疫荧光及透射电子显微镜检查,明确肺毛细血管通透性增加原因。第二部分研究免疫抑制合并Lp感染豚鼠小肠菌群失衡、易位及肝脏损伤情况。实验动物分组及免疫抑制模型的建立同第一部分。各组各实验时间点小肠内容物细菌16S rDNA进行测序、分析,明确各组小肠菌群失衡情况;各组各实验时间点肺、肝脏及血液细菌16S rDNA进行测序、分析,明确肠道细菌易位的存在及发生时机;肺、肝脏石蜡切片革兰氏染色及细菌探针荧光原位杂交进一步确认肠道细菌易位的存在;TUNEL、肝脏细胞程序性死亡相关蛋白检测,明确易位细菌对各组肝脏损伤机制及差异。结果:免疫抑制组豚鼠外周血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量明显降低,CD8~+T细胞数量减少,确认免疫抑制豚鼠造模成功。免疫抑制合并Lp感染豚鼠肺毛细血管通透性改变相关研究:随Lp感染时间延长,Lp感染组、免疫抑制合并Lp感染组豚鼠肺重量均不断增加,24h、48h两组肺重量相差无几,72h前者肺重量增加更显著。随着灌流时间延长,Lp感染组离体肺重量逐渐增加,其中48h增加最明显;免疫抑制合并Lp感染组24h离体肺重量逐渐下降,48h随灌流时间延长3只豚鼠离体肺重量逐渐下降,3只豚鼠离体肺重量明显升高,增幅高于Lp感染组48h,72h离体肺重量增加各组中最显著。肺组织VEGFA及VEGFR2表达情况,Lp感染组及免疫抑制合并Lp感染组各实验时间点均低于对照组。肺组织VE-cadherin表达情况,Lp感染组低于对照组,且48h最低;免疫抑制合并Lp感染组24h显著降低,随后继续降低,72h降至各组最低。透射电子显微镜(TEM)示Lp感染组24h内皮细胞肿胀,细胞连接部分开放,48h细胞连接完全开放,72h毛细血管内皮细胞皱缩、细胞连接模糊、开放;免疫抑制合并Lp感染组24h肺泡上皮细胞肿胀,毛细血管内皮细胞肿胀,两者间基膜模糊,细胞连接密度有所减低,部分开放,数量减少,48h毛细血管内皮细胞肿胀,细胞连接数量减少,密度间断减低,部分开放,可见Lp,72h组织超微结构破坏明显,肺泡上皮细胞肿胀,胞膜不完整,毛细血管内皮细胞胞核肿胀、核质边集,胞质明显肿胀,胞膜不完整,未见明确细胞连接。肺切片HE染色情况,Lp感染组肺组织损伤逐渐加重,至感染72h肺组织结构紊乱,肺泡及肺泡壁结构不清,广泛多量以中性粒细胞为主的炎性细胞渗出;免疫抑制合并Lp感染组肺组织病理改变不断加重,至感染72h可见大范围组织结构紊乱,大量肺泡腔内充满炎性渗出物,肺泡壁广泛增厚,数量减少。免疫抑制合并Lp感染豚鼠肠道菌群失衡、易位相关研究:对照组、免疫抑制组肺、肝脏及血液均未提取出细菌16S rDNA,对照组14例、免疫抑制组15例提取出小肠内容物细菌16S rDNA;Lp感染组肺9例、肝脏3例、血液6例、小肠内容物14例提取出细菌16S rDNA;免疫抑制合并Lp感染组肺9例、肝脏2例、血液1例、小肠内容物16例提取出细菌16S rDNA。对照组、免疫抑制组各时间点小肠内容物目水平优势菌群为拟杆菌目细菌;Lp感染组小肠内容物目水平优势菌群24h为拟杆菌目细菌,48h为芽孢杆菌目细菌,72h为肠杆菌目细菌;免疫抑制合并Lp感染组小肠内容物目水平优势菌群24h、48h均为拟杆菌目细菌,72h为肠杆菌目细菌。血液、肝脏及肺(Lp感染组24h、48h各2例及免疫抑制合并Lp感染组24h 3例)标本中凯斯坦波尔泉水无氧芽孢杆菌43.57±2.95%、火神地芽孢杆菌25.72±2.07%及产酸克雷伯杆菌16.00±1.99%三种菌为优势菌,而Lp为剩余的肺标本绝对优势菌。Lp感染组及免疫抑制合并Lp感染组肺、肝脏石蜡切片革兰氏染色可见革兰氏染色阳性细菌及上述细菌探针阳性表达。肠道易位细菌致免疫抑制合并Lp感染豚鼠肝脏损伤相关研究:对照组、免疫抑制组肝脏可见散在TUNEL阳性细胞;Lp感染组及免疫抑制合并Lp感染组可见较多TUNEL阳性细胞,且两组TUNEL阳性细胞大部分集中于肝脏被膜下。C Caspase-3及C Caspase-8表达情况,Lp感染组24h较对照组明显增高,48h最多,72h明显回落;免疫抑制合并Lp感染组24h较对照组显著增高,且逐渐增加。Lp感染组p-RIP-3表达一过性增高,而p-MLKL表达不断增加,72h达峰;免疫抑制合并Lp感染组p-RIP-3阳性表达不断增加,72h达峰,而p-MLKL 24h阳性表达最高,48h回落,72h再次明显增加。结论:1.免疫抑制豚鼠感染Lp较正常免疫力者肺毛细血管内皮细胞损伤更重、肺毛细血管通透性更高,平均肺动脉压在前者肺水肿形成过程中起到重要作用。2.相较肺水肿程度,肺毛细血管通透性改变程度能够更好的反映免疫抑制合并Lp感染豚鼠感染严重程度。3.Lp感染正常免疫力及免疫抑制豚鼠均出现肠道菌群失衡,及以凯斯坦波尔泉水无氧芽孢杆菌及火神地芽孢杆菌为主的肠道细菌易位,易位细菌诱发肝脏细胞凋亡及程序性坏死。