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背景与目的:在革兰氏阳性球菌中,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的致病性革兰氏阳性菌,是引起临床感染的最常见和致病的病原体之一,可引起多重感染,诸如呼吸道感染、心内膜炎、败血症和尿路感染。金黄色葡萄球菌能产生多种毒素和侵入性酶,可引起严重的传染病,并可产生多种抗药性基因,从而导致对抗生素的抗药性。金黄色葡萄球菌耐药与毒力一直是临床中最关注的两个方面。本论文拟从我院2012年-2016年各种临床标本分离的金黄色葡萄球菌的药敏情况进行回顾性分析,结合金黄色葡萄球菌的主要分离科室以及耐药种类,分析耐药种类和临床用药习惯之间的关系,为临床合理使用抗生素提供有力的依据。进一步从针对本院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）菌株的耐药基因、毒力基因和生物膜基因检测及进行多位点序列分析（MLST）分型,寻找MRSA和MSSA耐药分子流行病学依据。最后,通过金黄色葡萄球菌生物膜实验和金黄色葡萄球菌感染小鼠模型,验证携带耐药基因与毒力基因是否影响生物膜以及动物感染力,以及了解金黄色葡萄球菌引起小鼠菌血症的炎症反应。方法:1、临床样本分离鉴定、药敏分析、分布科室及临床资料分析按照《国家临床检验操作规程》（第三版）进行临床标本的分离培养。菌株鉴定和药敏试验采用全自动细菌鉴定仪VITEK 2 compact。采用K-B法测定替考拉宁的药敏性,用WHONE5.6版软件进行统计分析。回顾性查阅临床病历,结合金黄色葡萄球菌的主要分离科室的耐药种类,分析耐药种类和临床用药习惯之间的关系,以及与是否携带mecA与pvl基因有关系,以便将我们的临床研究结果应用于临床。2、分子流行病学研究（1）.对临床患者样本中的金黄色葡萄球菌进行分离,进一步检测其mecA基因,fem B基因及pvl基因,对mecA基因阳性的21株金黄色葡萄球菌的扩增产物进一步进行测序,测序后用Blast比对分析,表明这21株金黄色葡萄球菌均包含mecA基因。根据金黄色葡萄球菌的耐药表型,把21例菌株分为以下四组:（1）磷霉素敏感,莫西沙星耐药组;（2）磷霉素耐药,莫西沙星耐药组;（3）磷霉素耐药,莫西沙星敏感组;（4）磷霉素敏感,莫西沙星敏感组。分别对四组具有不同耐药表型的菌株的mecA基因序列分别进行组内比对和组间比对,并以Pubmed数据库的标准基因序列（NCBI序列号:NC＿002952）作为参照。多序列比对结果对比分析找到与磷霉素和莫西沙星耐药相关序列变化。2.根据mecA与pvl基因检测情况,将临床分离金黄色葡萄球菌分为四组:mecA（+）/pvl（+）;mecA（+）/pvl（-）;mecA（-）/pvl（+）;mecA（-）/pvl（-）,通过PCR方法进行耐药基因、毒力基因、生物膜基因进行检测及agr分型和MLST分型进行携带情况分析,比较四组金黄色葡萄球菌耐药基因、毒力基因、生物膜基因检测携带情况有无统计学意义,寻找MRSA及MSSA的流行病学依据。3、动物实验验证毒力将金黄色葡萄球菌分为四组:mecA（+）/pvl（+）;mecA（+）/pvl（-）;mecA（-）/pvl（+）;mecA（-）/pvl（-）,进行生物膜实验和小鼠动物实验,了解四组金黄色葡萄球菌生物膜形成情况及引起小鼠菌血症的炎症反应情况。结果:1、MRSA与MSSA耐药性比较及临床用药与耐药种类关系耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对抗菌药物的耐药性显著高于对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）,因此,解决MRSA的耐药性,在临床合理用药上具有非常重要的意义。样本主要来源科室为骨科和神经外科,查临床病历,了解金黄色葡萄球菌在这两个主要科室的耐药种类,分析与临床用药习惯之间的关系,为临床更好的选择抗生素治疗提供依据。2、分子流行病学研究（1）.对不同耐药表型对应的四组菌株的mecA基因进行测序,并将测序结果进行组内和组间比较。对比参考标准mecA序列（NCBI序列号:NC＿002952）,多序列比对结果表明,MRSA mecA基因序列,1332位点A碱基缺失可能与磷霉素耐药有关,MRSA mecA基因序列1801位点G碱基缺失可能与莫西沙星耐药有关。（2）.将临床分离金黄色葡萄球菌分为四组:一组:mecA（+）/pvl（+）;;二组:mecA（+）/pvl（-）;三组:mecA（-）/pvl（+）;四组:mecA（-）/pvl（-）,进行耐药基因、毒力基因、生物膜基因检测及agr分型和MLST分型进行携带情况分析,比较四组金黄色葡萄球菌耐药基因、毒力基因、生物膜基因检测携带情况得出:耐药基因实验结果表明在mecA+/pvl+组、mecA+/pvl-组、mecA-/pvl-组中耐药基因组阳性的表达率略高于mecA-/pvl+组,但组间比较结果差异不具有统计学意义（P＞0.05）;组内比较结果显示,耐药基因bla Z、erm A、erm B、dfr G、tet M在各组内的阳性表达率较高。组内比较结果不具有统计学意义（P＞0.05）。毒力基因实验结果表明在mecA+/pvl+组中毒力基因阳性的表达率明显高于mecA+/pvl-组、mecA-/pvl+组和mecA-/pvl-组,其中mecA-/pvl+组毒力基因阳性表达率最低,并且组间差异具有统计学意义（P＜0.05）,组间比较结果显示,毒力基因sea+、hla+、hlb+和agr1+在组间的阳性表达率较高,而tst+、eta+、etb+、agr2+、agr4+基因表达率低,比较结果具有统计学意义,P＜0.05;组内比较结果显示,在各组当中毒力基因hla+、hlb+、eta+、agr3+的阳性表达率较高,且组内比较结果具有统计学意义（P＜0.05）。（3）.将金黄色葡萄球菌分为四组:mecA（+）/pvl（+）;mecA（+）/pvl（-）;mecA（-）/pvl（+）;mecA（-）/pvl（-）,进行生物膜实验和动物实验,生物膜实验结果显示mecA（+）/pvl（+）组的生物膜厚度明显大于mecA（+）/pvl（-）组和mecA（-）/pvl（-）组（其中mecA（-）/pvl（+）样本量较少不参与统计）且具有统计学意义（p＜0.05）。3、动物实验验证毒力将金黄色葡萄球菌分为四组接种小鼠。A组:mecA（+）/pvl（+）;;B组:mecA（+）/pvl（-）;C组:mecA（-）/pvl（+）;D组:mecA（-）/pvl（-）,接种后48小时以及第7天,抽取存活小鼠的血清做IL6,IL1,和CRP检测,进行组间及组内统计分析。IL6结果显示:48小时的血清,接种mecA（+）/pvl（+）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（+）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,接种mecA（+）/pvl（+）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（-）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,接种mecA（+）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（-）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,有统计学意义;7天的血清:接种mecA（+）/pvl（+）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（+）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,接种mecA（+）/pvl（+）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（-）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,接种mecA（+）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（-）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,比较具有统计学意义。IL1结果显示:48小时的血清和第7天的血清在四组比较均无统计学意义;CRP结果显示:48小时的血清,接种mecA（+）/pvl（+）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（+）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,接种mecA（+）/pvl（+）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（-）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,比较有统计学意义;7天的血清:接种mecA（+）/pvl（+）金黄色葡萄球菌组和接种mecA（+）/pvl（-）金黄色葡萄球菌组,比较有统计学意义。结论:1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的耐药性高于甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）,因此,临床上需要重点关注MRSA的耐药性。金黄色葡萄球菌主要来源两个科室,分析与临床用药习惯之间的关系,为临床更好的选择抗生素治疗提供依据。2、mecA（+）/pvl（+）;mecA（+）/pvl（-）;mecA（-）/pvl（+）;mecA（-）/pvl（-）,四组金黄色葡萄球菌的菌株的耐药基因、毒力基因、生物膜基因的携带情况,mecA（+）组金黄色葡萄球菌的耐药基因阳性率显著高于mecA（-）组,指导临床合理用药。3、mecA（+）/pvl（+）具有明显增厚的生物膜,以及在动物实验中,具有较强炎症反应。