【背景】鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,Ab）可引起尿道感染、皮肤软组织感染、菌血症、脑膜炎、肺炎等多种感染性疾病,其中以耐碳青霉烯类Ab为代表的耐药菌感染引起的肺炎和脓毒血症可引发较高的死亡率。近年来,随着抗生素大量的不合理使用,催生出了一系列多重耐药鲍曼不动杆菌（Multi-drug resistance Acinetobacter baumannii,MDR-AB）,泛耐药鲍曼不动杆菌（Pan-drug resistant Acinetobacter baumannii,PDR-AB）。多种抗生素的联用已经无法有效控制鲍曼不动杆菌的感染。因此,为应对鲍曼不动杆菌紧迫而严重的耐药威胁,迫切需要研发新型抗生素、疫苗和其他治疗策略。目前国内外尚未有鲍曼不动杆菌疫苗进入人体临床研究阶段,在我国鲍曼不动杆菌疫苗的研究尚处于起步阶段。国外已开展的鲍曼不动杆菌疫苗临床前研究结果证实,灭活全菌、外膜囊泡、外膜复合物和OmpA等在动物感染模型中均具有一定的免疫保护作用,但由于上述疫苗成分、制备工艺复杂,内毒素含量高且不易去除,质量难以控制且安全性差,因此运用于临床鲍曼不动杆菌感染的免疫防治受到极大限制。与上述疫苗相比较,基因工程重组亚单位疫苗的优势在于疫苗组分明确、制剂安全可控、制备工艺简单,因此将可成为新型鲍曼不动杆菌疫苗研发的一个重要方向。在鲍曼不动杆菌感染的发病进程中一些外膜蛋白增强细菌对组织的粘附力,并有助于细菌免疫逃逸,并进一步侵入血液系统及相应组织脏器,引起菌血症和组织脏器局部感染。同时,以往多种革兰阴性菌疫苗的研究证实:外膜蛋白是一种免疫优势抗原,接种外膜蛋白疫苗后可以有效刺激机体产生免疫应答,增强机体对病原菌的抵抗力和清除能力,同时也可降低细菌对宿主的的粘附定植,减少细菌在局部的定植量,从而降低细菌感染引起的相应病发症和死亡率。上述研究结果都为外膜蛋白可作为鲍曼不动杆菌基因工程亚单位疫苗的一类重要候选抗原提供了理论依据。通过文献调研发现,Moriel等人运用反向疫苗学策略和蛋白质组学技术对鲍曼不动杆菌ATCC 17978菌株的免疫优势抗原进行了系统分析,预测出65个鲍曼不动杆菌免疫优势抗原。在此基础上,本课题从中遴选出35个抗原分子进行克隆表达,并对其进行了免疫保护作用初步评价。其中a1s₁969是预测出的一个鲍曼不动杆菌假定外膜蛋白,其晶体结构未解析,生物学功能、免疫保护作用尚未见文献报道。我们通过进一步生物信息学分析,a1s-1969基因在鲍曼不动杆菌菌株中高度保守,亚细胞定位分析显示其编码蛋白基因含有一段信号肽序列,三级结构预测分析其空间构象与淋球菌属的外膜蛋白bama相似。推断a1s₁969蛋白作为鲍曼不动杆菌的一种外膜蛋白,参与了信号转导、物质运输、毒素分泌等致病机制,在鲍曼不动杆菌生存代谢和感染力中发挥了重要作用,极具作为鲍曼不动杆菌免疫优势候选抗原的可能。【目的】为了评价a1s₁969蛋白的免疫原性和免疫保护性,探讨其作为鲍曼不动杆菌基因工程亚单位疫苗候选抗原的可能性,本课题在对a1s₁969进行生物信息学分析的基础上,确定a1s₁969蛋白的α螺旋区域（a1s₁969α）作为本疫苗的候选抗原及研究靶点,通过基因工程技术对其进行基因克隆和蛋白表达。在制备高纯度可溶性a1s₁969α重组蛋白的基础上,采用建立的小鼠全身感染模型对该重组蛋白的免疫原性和免疫保护性进行初步评价。以期为新型、有效的鲍曼不动杆菌疫苗的分子设计、抗原选择,以及后续重组亚单位/多亚单位鲍曼不动杆菌疫苗的研究奠定实验基础和理论指导。【方法】1.利用blast对a1s₁969基因的保守性进行分析,pcr检测45株临床分离菌株中a1s₁969基因序列的保守性。singalp-4.1和tmhmm在线软件进行亚细胞定位分析,swiss-model在线软件进行同源建模分析,对a1s₁969编码蛋白进行生物信息学分析。2.培养鲍曼不动杆菌国际标准菌株atcc17978,提取atcc17978基因组作为模板,通过pcr扩增a1s₁969α目的基因片段,经bamhⅠ和notⅠ两种限制性内切酶处理后导入pgex-6p-2表达载体,再将该重组表达载体转入大肠杆菌xl1-blue,构建pgex-6p-2-a1s₁969α/xl1-blue基因工程菌株。3.利用iptg对pgex-6p-2-a1s₁969α/xl1-blue基因工程菌株进行诱导表达,采用glutathionesepharose4b亲和层析提取gst-a1s₁969α融合蛋白,通过prescissionprotease酶切去除gst标签后获得a1s₁969α粗纯蛋白,经g25柱、qhp柱置换缓冲液和去内毒素获得精纯重组蛋白。采用hplc、bca法和鲎试剂法分别检测重组蛋白的纯度、浓度和内毒素;采用ms质谱检测a1s₁969α重组蛋白n-端氨基酸残基、毛细管电泳测定蛋白相对分子量,验证a1s₁969α重组蛋白的正确性。4.通过培养atcc17978菌株并绘制生长曲线,采用对数生长期细菌对balb/c小鼠进行腹腔攻毒感染,摸索不同细菌浓度的感染剂量,建立全身感染/致死模型。采用2.5×108cfu/只（ld50）感染balb/c小鼠,在不同时间点动态监测感染小鼠血液、肝脏、肾脏、脾脏和肺部的细菌定植量、血清炎症因子水平、各脏器病理改变、感染小鼠状态主观评分,对鲍曼不动杆菌balb/c小鼠全身感染模型进行系统评价。5.采用氢氧化铝佐剂吸附a1s₁969α重组蛋白,按0天、7天、14天免疫程序免疫balb/c小鼠,动态监测各针次免疫小鼠后血清中特异性抗体水平,绘制免疫后63天内（每间隔3天取血）抗体消长曲线,并对抗体亚型进行检测分析。评价a1s₁969α重组蛋白的免疫原性和免疫持久性。6.设计4种免疫剂量对balb/c小鼠进行免疫接种,采用4.2×108cfu/只（ld80）对免疫后balb/c小鼠进行攻毒感染,分别检测各剂量组感染小鼠的血液细菌定植量、小鼠血清炎症因子（il-1β、il-6、tnf-α）和小鼠生存率,评价各免疫剂量组的免疫保护性,优选出适宜的免疫剂量。7.采用完全弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂与a1s₁969α重组蛋白乳化后免疫家兔,收集并分离免疫后兔血清、经proteina层析纯化后检测特异性igg抗体。体外将小鼠源性及兔源性a1s₁969α特异性igg抗体、鲍曼不动杆菌、中性粒细胞共孵育,检测抗体介导下中性粒细胞对鲍曼不动杆菌的体外吞噬杀菌效率。体内将a1s₁969α特异性igg抗体经被动免疫后,检测攻毒小鼠各脏器细菌定植量、血清炎症因子水平（il-1β、il-6、tnf-α）及生存率。通过体内外水平评价a1s₁969α特异性抗体的被动免疫保护效果。【结果】1.生物信息学分析a1s₁969基因在ab菌株的序列一致性高达98%,通过pcr检测45株国内ab临床分离菌株中的a1s₁969基因扩增阳性率为83%,表明a1s₁969基因序列高度保守。亚细胞定位分析显示:在该基因编码蛋白n-端含有43个氨基序列长度的信号肽分子,序列均在膜外区。蛋白质三维空间结构预测分析显示:a1s₁969与外膜蛋白bama具有38.42%相似度。综合分析预测a1s₁969为鲍曼不动杆菌的外膜蛋白。2.成功扩增了a1s₁969α目的基因片段,分子量大小为1107bp（136¹242bp）,成功克隆构建了pgex-6p-2-a1s₁969α/xl1-blue重组基因工程菌株,经酶切鉴定重组质粒及测序分析表明,与理论设计完全一致,a1s₁969α重组基因工程菌株构建成功。3.不同温度下对pgex-6p-2-a1s₁969α/xl1-blue重组基因工程菌株进行诱导表达,经sds-page电泳显示:30℃下iptg诱导3h获得高表达gst-a1s₁969α融合蛋白;分级纯化后获得的a1s₁969α重组蛋白纯度大于95%,内毒素含量合格（小于10eu/mg）,重组蛋白n-端氨基酸残基序列为:nh2-gly-pro-leu-gly-ser-asp-phe-val-val-arg-asp-ile-arg-val-asn,相对分子量为42.233kd,与理论完全一致。4.37℃培养鲍曼不动杆菌atcc17978菌株,测定不同时间下菌液吸光度值并绘制细菌生长曲线,5⁸h期间细菌生长最为迅速,为对数生长期;摸索出各细菌感染浓度下balb/c小鼠的死亡率,亚致死剂量为2.0×109cfu/只,ld50剂量为2.5×108cfu/只,ld70剂量,3.0×108cfu/只,ld80剂量为4.0⁵.0×108cfu/只,ld100剂量为6.0×108cfu/只,12h¹6h为感染小鼠死亡高峰期。ld50剂量感染小鼠后6¹2h期间小鼠血液、各脏器细菌负荷量达到高峰,24h后各脏器内ab基本被机体清除;感染后6h¹2h小鼠血清中il-1β、il-6和tnf-α炎症因子水平较高;观察感染12h后小鼠肺、肝脏、肾脏he染色病理切片显示:感染12h后各脏器出现炎性细胞浸润,随着感染时间的延迟炎性细胞浸润增强,感染48h后各脏器均出现明显的病理损坏。观察感染小鼠状态发现:小鼠感染后第3h产生高热、背毛耸立、活动度减少,感染第6h后小鼠活动度进一步减少、大小便失禁,感染12h后小鼠体温降低开始出现死亡,感染第24h小鼠活动度增加开始进食。5.连续检测a1s₁969α免疫后小鼠血清中igg特异性抗体水平显示:a1s₁969α重组蛋白可刺激小鼠产生高滴度特异性igg抗体,在末次后第28天igg几何平均滴度达到7.0×105,并且抗体滴度能长时间维持在一个较高的水平。通过抗体亚型检测分析显示:a1s₁969α特异性igg抗体亚型以igg1为主。6.4种免疫剂量的小鼠免疫攻毒实验结果显示:感染小鼠后,与对照组相比较,小鼠血液中荷菌量明显高于30μg组（p<0.05）、60μg组（p<0.01）和120μg组（p<0.01）,对照组与15μg组无明显差异;60μg组和120μg组小鼠血清炎症因子（il-1β、il-6和tnf-α）明显低于对照组,60μg组（p<0.01）,120μg（p<0.01）;60μg组和120μg组免疫小鼠与对照组相比较可明显提高小鼠生存率,60μg组小鼠生存率为70%（p<0.05）,120μg组小鼠生存率为80%（p<0.01）,最终优选出120μg为适宜免疫剂量组。7.体外中性粒细胞吞噬实验结果显示:小鼠源性和兔源性A1S₁969α特异性Ig G抗体介导中性粒细胞对ATCC 17978菌株的吞噬率分别为58.68%和70.09%,与阴性对照组具有显著性差异（p<0.01）。体内的被动免疫攻毒保护实验结果显示:免疫组小鼠血液、各脏器中荷菌量明显低于阴性对照组,具有显著性差异（p<0.01）;免疫组小鼠血清炎症因子水平（IL-1β、IL-6和TNF-α）明显低于对照组小鼠(（p<0.01）;免疫组小鼠生存率为90%,显著高于阴性对照组（p<0.01）。【结论】1.通过基因工程技术成功构建pGEX-6p-2-A1S₁969α/XL-1Blue重组表达工程菌株,经诱导表达和多级纯化后获得高纯度的可溶性A1S₁969α重组蛋白,经HPLC、N-端氨基酸测序、分子量测定等质量检定,A1S₁969α与理论完全相符,达到疫苗抗原的质量标准要求。2.通过腹腔攻毒感染途径明确了感染剂量,建立了稳定可靠的鲍曼不动杆菌小鼠全身感染/致死模型,为后续筛选和鉴定鲍曼不动杆菌免疫优势抗原奠定了坚实的实验基础。3.A1S₁969α重组蛋白动物主动免疫和被动免疫攻毒保护实验结果证实,A1S₁969α免疫机体后可激发高效的保护性免疫应答,促进机体对鲍曼不动杆菌的清除,抑制炎因子的表达,抑制鲍曼不动杆菌感染所引起的病理损伤,并显著提高了小鼠生存率,具有良好的免疫原性和免疫保护性。4.本课题首次克隆表达并成功制备了A1S₁969α重组蛋白,证实其具有良好的免疫保护作用,可作为鲍曼不动杆菌重组亚单位疫苗的重要候选抗原之一。