菠萝是重要的热带水果之一,菠萝果实内的糖含量多少直接影响其品质,糖是构成果实品质和风味物质的主要成分,也是色素、氨基酸、维生素和芳香物质等营养成分合成的基础原料,菠萝果实糖含量的多少是决定其品质的重要原因,为了探讨菠萝果实发育过程中糖分的积累和代谢。本研究通过对菠萝果实不同部位、不同品种、不同产期的果实糖代谢的差异,以及与蔗糖代谢相关酶活性及基因表达的关系进行分析,以揭示菠萝果实糖代谢的变化规律和影响因子,为科学调控菠萝果实品质提供理论依据。主要研究结果如下:　　 1.通过对‘巴厘’菠萝果实发育过程中不同部位之间糖积累及其糖代谢相关酶活性研究发现,菠萝果实不同部位之间糖积累存在差异,果实成熟时基部含糖量最高,然后依次为中部、顶部、果心,而且酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性与糖含量有着相似的梯度变化,据此认为,果实不同部位中AI、NI和SPS活性的差异是造成它们糖积累差异的主要原因。　　 不同部位,蔗糖含量与酶活性的关系不一致。中部和基部在花后70d前,SS和SPS活性对蔗糖积累的影响较大;进入成熟期(花后70d后),蔗糖的迅速积累主要与SPS活性的升高和NI活性的降低有关。而顶部和果心在花后70d前,蔗糖积累主要受SS活性的调控;而进入成熟期(花后70d后),果心的蔗糖积累主要受AI、NI和SPS活性调控,而顶部与中部、基部一致,主要受NI和SPS活性的调控。　　 同时,在进入果实成熟期之前(花后70d之前)酶的净活性对菠萝果实不同部位的糖积累的影响较大,但对进入成熟期(花后70d后)后其影响较小。总之,果实成熟期蔗糖的积累,主要受NI和SPS这两种酶活性的综合调控。　　 2.通过比较相同季节成熟的‘巴厘’和‘无刺卡因’菠萝果实的生长发育及其发育过程中糖积累及蔗糖代谢相关酶活性发现,两种果实的生长曲线都符合单‘S’曲线模型,幼果期果实生长较缓,迅速生长期果实生长加快,成熟期果实生长又减缓,整个生长周期仅有一个生长高峰;不同菠萝品种主要积累糖的种类也不同,‘巴厘’品种是以积累蔗糖为主,己糖与蔗糖的比值约为0.65;而‘无刺卡因’品种是以积累己糖为主,己糖与蔗糖的比值约为5.92。　　 不同的蔗糖代谢酶活性决定了不同品种果实中积累糖的种类不同,积累蔗糖为主的‘巴厘’具有高的SS和SPS活性,转化酶活性较低;积累己糖为主的‘无刺卡因’的SS和SPS活性较低,转化酶活性较高。不同品种蔗糖代谢相关酶在糖积累中的作用不同,相关性分析表明,‘巴厘’果实中主要调控蔗糖积累的酶是SPS+NI+AI,而‘无刺卡因’果实主要由NI+AI调控。　　 3.通过对不同产期的‘无刺卡因’菠萝果实的生长发育及其发育过程中糖积累及糖代谢相关酶活性研究发现,不同产期的果实发育存在差异,2月份采收的冬季果果实发育规律为非典型的单‘S’型(快一慢),而7月份采收的夏季果果实发育规律为典型的单‘S’型(慢-快-慢),且后者比前者果实发育期短40d。不同时期采收的菠萝果实糖的积累存在差异,2月份采收的冬季果成熟时,己糖/蔗糖的比值为0.37,主要以积累蔗糖为主;而7月份采收的夏季果成熟时,己糖/蔗糖的比值为5.92,主要以积累己糖为主。　　 不同时期采收的菠萝果实其蔗糖积累与蔗糖代谢酶的关系存在明显差异。2月份采收的果实其蔗糖积累多主要与SPS和SS的合成活性升高,转化酶活性降低有关。7月份采收的果实其蔗糖积累少主要与转化酶活性的升高有关。　　 4.获得高质量的RNA是进行基因表达水平分析的关键。本实验针对菠萝果实富含多糖、多酚、蛋白质等大量次生物质的特点,比较了改良SDS法、改良CTAB法和Trizol试剂盒法提取菠萝果实不同部位的总RNA,得出改良SDS法效果较佳,A260/A280和A260/A230接近2.0,且产量可达到464.3μg·g-1·FW以上。在提取过程中,采用了1/3体积5 mol/L Kae(pH 4.8)选择性沉淀多糖,酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)2次抽提有效去除蛋白及1/4体积12 mol/L LiCl从基因组中选择性沉淀RNA等关键性步骤,可得到了高质量的总RNA,满足了后续RT-PCR半定量分析的需求。　　 5.蔗糖代谢相关酶基因的克隆是进一步从分子水平研究其作用机理和调控机制的前提。本试验克隆了3个蔗糖代谢相关酶基因的cDNA片段,分别是蔗糖磷酸合成酶基因(Ac-SPS1)的cDNA片段(1131bp)、蔗糖合成酶基因(Ac-Sy1)的cDNA片段(360bp)和中性转化酶基因(Ac-NI1)的cDNA片段(1036bp)。序列分析表明,Ac-SPS1基因编码377个氨基酸,含有典型的糖基转移酶结构域,包含SPS蛋白家族的两个丝氨酸保守结构域,一个为14-3-3蛋白特异结合位点,另一个是渗透胁迫的激活位点,它们可被相应的蛋白激酶/磷酸酶分别磷酸化/脱磷酸化而改变酶活性,也可与14.3-3蛋白特异结合改变酶活性。Ac-Sy1基因片段编码120个氨基酸,位于糖基转移酶结构域内。Ac-NI1基因片段编码345个氨基酸残基,含有植物中性转化酶结构域。　　 6.建立了一套优化的适合菠萝果实蔗糖代谢相关酶基因的半定量RT-PCR体系。实验选定16S rRNA为内参,采用同管(Ac-SPS1和Ac-NI1)和异管(Ac-Sy1)异时的扩增方法,如对Ac-Sy1、Ac-SPS1和Ac-NI1基因的表达就是先让目的基因分别扩增到第14个、第16个和第16个循环后才加入内参引物,然后再扩增20个循环,这样使得内参和目的基因同处于对数扩增期。　　 7.本实验采用优化的半定量RT-PCR方法对‘巴厘’果实不同部位中Ac-SPS1、Ac-Sy1和Ac-NI1三个基因的表达进行了分析。研究发现在果实发育初期,Ac-SPS1基因在果实顶部、中部和基部呈微弱表达,之后随着果实的发育,基因表达量提高,并于花后70d达到表达高峰,成熟期(花后70d-80d)表达水平快速下降,亦即基因表达高峰比该酶活性高峰提前10d;果心中Ac-SPS1基因表达规律略有不同,其表达高峰出现在花后50d,之后波动下降,成熟时下降到最低值。果实4个部位中Ac-NI1基因表达的变化规律与其酶活性变化规律较为相似,在果实发育初期较低,之后迅速上升,于花后40d(果心部为花后30d)达到表达高峰,然后迅速下降,成熟时表达量极低。果实不同部位中Ac-Sy1基因表达规律不太相同,总体上看,顶部、中部、基部的Ac-Sy1基因表达在果实发育中期(花后40d-50d)和成熟时表达较强,且与酶活性的变化规律不一致。这些研究结果说明,果实顶部、中部、基部的Ac-SPS1、Ac-NI1基因表达与酶活性之间存在着密切关系;果心的Ac-SPS1基因表达与酶活性之间的关系不紧密,而Ac-NI1基因表达与酶活性变化密切相关;不论在果实的顶部、中部、基部或果心,Ac-Sy1基因的表达与酶活性之间没有明显的联系。　　 总之,果实顶部、中部和基部Ac-SPS1、Ac-Sy1和Ac-NI1基因的表达对蔗糖的积累起着主要的调控作用,蔗糖随着Ac-SPS1和Ac-Sy1基因表达的增强,Ac-NI1表达水平的下降而积累。果心中蔗糖随着Ac-NI1基因的表达增强而积累,同时花后60d前Ac-SPS1基因的表达也对蔗糖的积累有影响,而蔗糖的积累受Ac-Sy1基因表达的影响较小。表明Ac-SPS1、Ac-Sy1和Ac-NI1基因的表达在菠萝果实的蔗糖积累过程中起着重要的生理功能,它们共同调控着蔗糖的积累,而且,这三个基因的表达具有组织和发育特异性。