正常细胞与其周围的组织环境之间存在动态平衡,两者共同作用可以调控细胞增殖、分化、凋亡以及细胞表面相关因子的分泌和表达。在肿瘤发生恶变的过程中,这一平衡遭到破坏。肿瘤细胞无限增殖,就需要不停地建立适于自己生长的外部组织环境,此即肿瘤微环境。肿瘤微环境中,存在着正性和负性免疫成分,包括巨噬细胞Mφ、粒细胞、效应T细胞(Tc)、调节性T细胞(Tregs)、失能状态T细胞(Anergic T cell )等。在肿瘤发生和发展的不同阶段,由于微环境中免疫细胞亚群数量和功能的改变,以及产生不同的细胞因子和介导不同的免疫应答,导致免疫系统从免疫监视功能对肿瘤耐受,并呈现共生存,最后促形成肿瘤免疫逃逸。由此看来,肿瘤浸润免疫细胞看来更象是一把“双刃剑”,在肿瘤的发生和进展中发挥重要作用。肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸的因素主要是功能异常的抗原递呈细胞(括树突状细胞和巨噬细胞)、髓样抑制细胞和调节性T细胞、以及肿瘤细胞和间质细胞异常高表达负性免疫分子。“协同刺激信号”是1970年由Bretscher和Cohn在T细胞活化双信号模型的基础上提出的,随着研究的不断深入,介导协同刺激信号的协同刺激分子已成为免疫学研究新的热点之一。近年,一些协同刺激分子被发现在多种肿瘤中异常表达。肿瘤细胞协同刺激分子的表达改变,包括正性协同刺激分子表达的下降以及负性协同刺激分子表达的增高,参与了肿瘤免疫逃逸、肿瘤转移与迁徙等过程,是构成肿瘤微环境的重要因素。近年发现的B7家族的一系列新成员在肿瘤中的异常表达,使得对B7家族协同刺激分子的关注不断增加。B7-H3是2001年从人DC的cDNA库中克隆得到的B7家族的一个成员。人B7-H3基因定位于15q24,属免疫球蛋白家族的I型跨膜蛋白。人B7-H3mRNA在人类组织中广泛表达,而蛋白在正常组织几乎不表达。鼠和人B7-H3都具有包括一个IgV样和一个IgC样的双区域结构(2IgB7-H3),而人和其他灵长类动物证实还具有IgV-IgC-IgV-IgC(4IgB7-H3)的四区域结构。最初的研究表明B7-H3能刺激CD4+T细胞的增殖,使CTL活性增加,同时提高IFN-γ的分泌和表达,被认为是一正性协同刺激分子。随后的研究发现, B7-H3信号可负性调控T细胞的活化及其介导的免疫应答,因此认为B7-H3可能是一负性协同刺激分子。由于B7-H3的受体目前尚未确认,使得对其功能的研究难以深入开展。业已表明,B7-H3蛋白在诸多肿瘤组织中高表达,呈现在肿瘤细胞表面及胞浆里,在肿瘤血管也有表达,尤为有意义的是异常表达的B7-H3分子与肿瘤的临床病理因素和预后相关,显示其在肿瘤发生和进展中的重要作用。目前,对于B7-H3分子在肿瘤组织中异常表达的调节机制,以及B7-H3分子如何参与肿瘤免疫应答的调控机制尚待研究。结直肠癌是人类最常见的癌症之一,在世界范围内发病率及死亡率居恶性肿瘤第四位。结直肠癌的发生呈现出从正常组织,经过息肉、腺瘤、高级别瘤变等病变缓慢发展至癌的漫长过程,微环境中免疫细胞的浸润、免疫因子的产生及其与肿瘤细胞的相互作用,发挥了极其重要的作用。本文在B7-H3分子在结直肠肿瘤微环境表达的临床意义的基础上进一步探讨及B7-H3对肠癌肿瘤微环境中浸润免疫细胞的作用和机制。第一部分协同刺激分子B7-H3在人结直肠癌中表达的临床意义【目目的】检测人结直肠癌组织中协同刺激分子B7-H3的表达,分析其表达与肠癌临床病理因素及患者生存时间的关系,探讨B7-H3的表达在肠癌演进过程中的意义。【方方法】收集肠癌手术切除的组织219例,统计患者的病理资料及生存时间;分别收集肠癌演进过程中的各阶段病变组织,包括息肉、腺瘤、高级别瘤变和肠癌组织。通过免疫组织化学染色方法,分析B7-H3分子在肠癌组织中的表达,统计学分析其表达的意义。【结结果】免疫组化结果显示,219例结直肠癌患者中,99例患者组织低表达B7-H3分子,占45.2%;120例患者组织高表达B7-H3分子,占54.8%。B7-H3在肠癌组织的表达水平与患者性别、肿瘤部位、淋巴结转移、远处转移以及是否粘液腺癌无显著相关性;而与患者的年龄、肿瘤大小、分化程度以及肿瘤的分期密切相关。生存分析显示B7-H3表达水平与肠癌患者生存率的相关性虽无显著统计学意义,但40个月后的生存情况显示了B7-H3低表达患者的生存率高于B7-H3高表达患者的趋势。进而研究发现B7-H3在腺瘤阶段就呈现表达,而后高表达在高级别瘤变及肠癌组织中,B7家族其他负性分子B7-H1、B7-H4则仅局限在肠癌组织中表达。【结结论】协同刺激分子B7-H3在肠癌组织中异常高表达,并与肠癌的分期和肿瘤进展密切相关;B7-H3在结直肠演变早期阶段即表达,是B7家族负性分子中最早参与肠癌事件发生的分子,这些均提示B7-H3分子参与了肠癌演进的整个过程并发挥重要的作用。第二部分可溶性B7-H3分子在肠癌患者外周表达的临床意义及产生机制【目目的】检测可溶性B7-H3分子在肠癌患者外周血的表达,分析其临床意义;探讨B7-H3在肠癌细胞异常表达的调节机制及可溶性B7-H3分子的产生机制。【方方法】收集肠癌患者术前外周血标本56例和健康人外周血60例,统计患者病理资料。采用酶联免疫标记法测定可溶性B7-H3分子在正常人及肠癌患者外周的表达,统计学分析其临床意义。流式细胞术检测肠癌细胞株B7-H3分子的表达,采用细胞因子TNF-a、IFN-γ体外作用肠癌细胞后,使用流式细胞术、酶联免疫标记及PT-PCR方法分析其膜型和可溶性B7-H3及B7-H3mRNA表达的改变,以及RT-PCR分析肠癌细胞B7-H3分子两种异构体的表达和细胞因子对其调节作用;使用基质金属蛋白酶抑制剂(MMPI)抑制可溶性B7-H3的表达。【结结果】ELISA结果显示,正常人外周血存在16.8±7.48ng/ml的可溶性B7-H3分子,肠癌患者外周血中可溶性B7-H3分子表达水平明显升高(30.34±11.93ng/ml);可溶性B7-H3分子在肠癌外周血中的表达水平与肠癌的淋巴结转移以及远处肝转移密切相关;五株肠癌细胞株表面均存在不同程度的B7-H3分子的表达,TNF-a能促进肿瘤细胞分泌可溶性B7-H3分子,上调2IgB7-H3mRNA的表达。肠癌细胞分泌可溶性B7-H3分子可被MMPI抑制。【结结论】可溶性的B7-H3分子存在于肠癌患者外周血及正常人外周血中,肠癌患者外周可溶性B7-H3分子水平较正常人显著增高。高表达的可溶性B7-H3分子与肠癌的淋巴转移和远处肝转移密切相关,由此提示膜型和可溶性B7-H3分子在肠癌分别介导不同的作用,调控外周和局部的肿瘤微环境影响肿瘤的进展。B7-H3的表达受到肠癌中重要的炎症因子TNF-a的调节,TNF-a可促进2IgB7-H3转录,上调可溶性B7-H3的表达,由此表明2IgB7-H3是可溶性B7-H3的主要来源。肠癌细胞分泌可溶性B7-H3分子主要由金属蛋白酶切割B7-H3膜分子所产生。第三部分协同刺激分子B7-H3对肠癌肿瘤微环境免疫细胞的作用机制【目目的】研究肠癌微环境中的免疫细胞的浸润及临床意义,分析B7-H3分子的异常表与浸润淋巴细胞的关系,探讨B7-H3调控肿瘤免疫应答的可能机制。【方方法】通过免疫组织化学染色分析肠癌组织中浸润T淋巴细胞亚群、巨噬细胞的数量,统计学分析其浸润与肠癌预后的关系;分析B7-H3的表达与肠癌微环境中免疫细胞浸润的关系;采用然高表达B7-H3分子的肠癌细胞株CW-2细胞体外与单核细胞共同培养,流式细胞术及RT-PCR检测诱导的巨噬细胞标志分子的表达,酶联免疫标记分析诱导的巨噬细胞细胞因子的分泌;使用B7-H3中和型抗体阻断实验,分析B7-H3信号的封闭对单核细胞分化成肿瘤巨噬细胞的作用;流式细胞术分析活化的单核细胞上B7-H3分子可能受体的表达。【结结果】IHC染色显示,在肠癌组织大量浸润着CD3+T细胞、CD8+T细胞以及CD68+TAM;CD3+T细胞在肠癌组织的浸润和肠癌患者的生存时间密切相关,而CD8+T细胞在肠癌组织的浸润和肠癌患者的生存时间关系无统计学意义,B7-H3的表达水平与CD3+T细胞及CD8+T细胞在肠癌组织浸润的数量均无相关性;CD68+TAM在肠癌组织的浸润和肠癌患者的生存时间密切相关,且B7-H3和在肠癌浸润的CD68+TAM细胞数量成正相关。在肠癌细胞表面表达的B7-H3分子和肿瘤微环境细胞因子的共同作用下,诱导的单核细胞表达低水平的MHC-Ⅱ分子(DR)和较高水平的MMR(CD206),几乎不表达iNOS,分泌高水平的IL-10和TNF-a,表现出M2型巨噬细胞表型;经B7-H3中和型抗体作用后,肠癌细胞诱导的巨噬细胞上调表达DR和iNOS,下调表达MMR,同时IL-10和TNF-a的分泌部分受到抑制,由此表明肿瘤B7-H3分子是促进单核细胞向肿瘤巨噬细胞的转化的关键信号。体外实验显示,经LPS激发后,诱导的单核细胞表面上调表达与B7-H3融合蛋白结合的可能受体。【结结论】本部分研究表明,浸润CD3+T细胞与肠癌患者的生存时间密切相关,再次证实T细胞应答在肿瘤免疫中的重要作用,而CD8+T细胞浸润的程度与肠癌患者的预后并无直接关系,表明了肿瘤微环境中的CD8+T细胞的异质性,可能其肿瘤微环境中处于失能状态。B7-H3分子在肠癌肿瘤微环境中的表达与T细胞浸润不相关,而与肿瘤巨噬细胞浸润数量正相关,提示肿瘤B7-H3分子并非是通过调控T细胞的浸润来参与肿瘤免疫的,而是肿瘤巨噬细胞。肿瘤B7-H3分子可以促进单核细胞在肿瘤微环境中向M2型巨噬细胞的分化,分泌抑制肿瘤免疫应答的细胞因子,阻断B7-H3信号可以抑制M2型巨噬细胞的分化;B7-H3的可能受体被发现上调表达在活化的单核细胞上,表明肿瘤性B7-H3信号可通过调节肿瘤浸润巨噬细胞的分化参与肿瘤免疫应答的调节,这为B7-H3分子参与肿瘤免疫应答的机制研究提出新的思路。综上所述,本课题通过分析膜型和可溶型B7-H3分子在结直肠癌的表达及其临床意义,进而探讨了B7-H3分子在肿瘤微环境中通过调控肿瘤巨噬细胞的分化进而参与肿瘤免疫逃逸的作用机制,为寻找肠癌诊断的生物学指标及设计有效的肠癌干预手段提供了新的理论基础,具有原创性和潜在的应用价值。