桑树是多年生叶用木本植物,桑叶是蚕丝业的物质基础,桑叶的大小形状与经济产量密切相关,对桑树叶片的生长发育和形态建成机理进行研究,具有特别重要的意义。为探讨桑树叶片发育的分子机制,以桑树叶形变异株“凤尾一之濑”和野生型“新一之濑”的顶芽和叶片为试材,进行了组织学和分子机理的研究。桑树变异株系凤尾一之濑是由新一之濑冬芽经60Coγ射线诱变处理后,形成的叶片形态变异株系,叶片细长,横向皱缩。本研究利用组织切片技术观察了桑树变异株系的叶片组织形态的变化。采用cDNA-AFLP(cDNA扩增片段长度多态性)技术进行叶片形态变异株系和野生型的mRNA差异表达分析。得到了如下几条主要结论：1.桑树品种新一之濑和其变异株系凤尾一之濑在叶片指数上存在显著差异,新一之濑为1.17,凤尾一之濑为3.05。两者的幼叶厚度基本没有差异,但凤尾一之濑的成熟叶比新一之濑稍厚。两者在叶片组织结构,细胞层数和表皮结构等方面沿叶片的纵横轴没有明显的差异。2.应用Trizol,可以获得高质量的桑树RNA样品,可应用于cDNA反转录、Northern杂交等。应用PolyATtract(?) mRNA Isolation Systems (Promega)提取桑树顶芽总RNA,利用SMARTTM cDNA library construction kit (Clontech)中的LD-PCR方法合成cDNA,以及利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法,都得到良好的实验结果,这些技术可以满足桑树cDNA-AFLP的要求。3.利用AseⅠ和TaqⅠ对cDNA进行双酶切后,连接寡聚核苷酸接头,利用有两个选择性碱基的引物进行PCR扩增,结果显示,在所用材料相同的情况下,不同的引物组合有不同的电泳图谱,同一引物组合可以得到相同的条带。而且在克隆得到的DNA片段序列中含有特定的接头和选择性碱基序列(选择性引物序列),表明cDNA-AFLP方法具有较高的可靠性和重复性。4.本研究共选用8个TaqⅠ和8个AseⅠ引物,共64对引物组合进行选择性扩增,每个引物组合扩增的条带数可达50条以上,条带清晰,共扩增得到大约3200个条带,在新一之濑和凤尾一之濑之间,大约有30个条带只在其中一个品种的扩增图谱中出现,呈现明显的差异表达,这些条带代表了在叶片形态突变体与野生型之间差异表达的基因。5. cDNA-AFLP电泳图谱表明,在桑树叶形突变体和野生型之间,大部分条带是相同的,反映了大部分生理过程是相同的。少数条带存在差异,反映了造成二者之间性状差异的遗传改变。结果表明用cDNA-AFLP对桑树叶形变异株系进行差异显示分析的实用性。6.对聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到的差异条带进行了克隆和测序分析,在所得到的15个基因片段中,有2个与已知基因有同源性,一个为脯氨酰4-羟化酶a亚基基因,该片段来自新一之濑。另一个是羟甲基转移酶基因,该基因片段来自凤尾一之濑。其他片段与已知的功能基因尚没有发现同源性。用5个克隆片段作为探针用于Northern杂交,没有发现明显的差异,说明这些突变的基因位点可能是点突变。7.本研究建立了一套应用于桑树变异株系表达差异显示的技术体系,从现有的资料看,本研究的内容,在桑树研究中应属首次报道。从得到的结果看,该方法费用少,有较强的可行性。8.从桑树现有的大量诱变株系入手,可以得到一些特殊基因序列。本研究为利用我国丰富的桑树种质资源,分离有特殊应用前景的目的基因应用于桑树分子育种领域,开创了新的研究途径和方法。9.本研究利用桑树叶片形态变异株和野生型进行mRNA表达差异显示分析,所得到的基因片段可能与桑树的叶形发育有某些相关性。对所得到的基因片段可以进一步克隆全长,研究基因功能。本研究为进一步研究叶片性状变化和发育分化的分子机理研究奠定了基础。