畜产品中β-兴奋剂ELISA快速检测方法的建立与检测

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β-兴奋剂(β-adrenergic agonist)是苯乙醇胺的一类衍生物。对动物体具有促进肌肉组织生长,影响脂肪含量,能提高动物组织的瘦肉率和增加瘦肉的产量。高残留的β-兴奋剂,会产生极强的毒副作用,甚至危及生命。现在人工合成的β-兴奋剂有十余种,克伦特罗,沙丁胺醇,莱克多巴胺是目前国内外主要常用的β-兴奋剂。目前,欧美等国家都限制了其在畜牧生产上的使用,我国各部门包括卫生部,农业部,国家药品监督管理局共同发布的公告中,都明确规定和禁止了β-兴奋剂药物在饲料和动物饮用水中的使用。因此,开发针对动物源性食品中的β-兴奋剂的快速检测方法,对保障食品安全具有重要意义。为了建立快速、灵敏、低成本、高通量的β-兴奋剂残留免疫学研究分析方法,本研究在分析β-兴奋剂免疫学特性的基础上,利用β-兴奋剂的单克隆抗体,建立了β-兴奋剂的酶联免疫分析方法以及应用。主要成果如下:(1)β-兴奋剂间接ELISA分析方法的建立分别对包被原的浓度、抗体稀释的倍数、抗体稀释液的选择、抗体反应的时间、pH值等参数进行优化,建立了间接ELISA检测方法。最终确定包被抗原浓度为250μg/L;抗体稀释浓度是127μg/L;离子浓度为0.2 mol/L的PB缓冲液,最佳pH值为7.2;一抗反应时间为30 min。对猪尿液的添加回收率为80.0-104.0%,该方法灵敏度高、回收率好、假阳性率少,测定结果准确。(2)β-兴奋剂试剂盒的制备采用间接竞争ELISA法构建β-兴奋剂试剂盒。通过棋盘法和单因素实验优化条件建立标准曲线,检测半抑制浓度克伦特罗IC50为1.18μg/L,沙丁胺醇IC50为1.42μg/L。克伦特罗线性范围IC20-IC80为:0.31-4.52μg/L,检测限为0.05μg/L;沙丁胺醇线性范围IC20-IC80为:0.70-5.32μg/L,检测限为0.10μg/L,检测范围为0.05-4.5μg/L;与克伦特罗(CLB)的交叉率是100%,与沙丁胺醇(SAL)的交叉率是83.1%,与马布特罗(MBL)的交叉率是42%,与溴布特罗(BBL)的交叉率是25.82%,与氯丙那林(CPL)的交叉率是9.16%,与西马特罗(CML)的交叉率是5.41%,与莱克多巴胺(RAC)的交叉率少于5%;试剂盒在37℃存放6天,在4℃存放一年以上,试剂盒的灵敏度变化较小,稳定性较好;批间和批内的变异系数均<15%,方法精密度高;样品的添加回收率在80.0%-104.0%之间,方法准确度高,样品假阳性少。将试剂盒产品应用于实际样品检测,效果良好。
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