遗传病是指由遗传物质发生改变而引起或者由致病基因所控制的多类疾病的总称。其发病率高,病种多,表型复杂。大部分遗传病发病机制不清,因此只能对症治疗,延缓疾病进展。过去的研究中,已建立多例遗传病的动物模型,这些动物模型有助于我们进一步了解遗传病复杂的发病机制。但由于模式动物和人类存在种属差异,多数情况下无法完全再现人类疾病发生发展的过程。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)来源于患者,能够保留患者遗传学缺陷,因此可作为研究各类遗传病的绝佳模型,并且iPSC作为与患者相配的细胞,也可应用于再生医学,为更多遗传病的治愈带来可能。导师许争峰课题组一直致力于将iPS技术应用于遗传病的研究。在前期的工作中,我们建立了羊水细胞(amniotic fluid cells,AFC)以及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)重编程为iPSC的平台,并且建立了线粒体遗传病肌阵挛伴破碎红纤维综合症(myoclonic epilepsy and ragged red fibers,MERRF)的iPSC疾病模型。本研究分为两部分内容,在第一部分中,我们首先将之前重编程获得的MERRF患者来源的iPS细胞进行心肌分化及功能表型鉴定,并将iPSC及心肌细胞进行转录组测序,结合共表达网络分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)探索MERRF综合征在心肌损伤中的新分子机制;第二部分,对几种常见遗传病,包括21三体综合征(trisomy 21 syndrome,T21)、苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)和威廉姆斯综合征(Williams syndrome)进行iPSC疾病模型的建立,并通过对这些iPSC进行转录组测序与WGCNA分析,在分子水平探索这几种常见遗传病的发病机制。目的 MERRF是由线粒体突变导致的一种遗传病,致病位点多在线粒体DNA第8344位,除了肌阵挛性癫痫和小脑共济失调等主要症状以外,约53%的患者同时存在心肌损伤,本研究通过将MERRF患者来源的iPSC分化为心肌细胞,建立疾病的心肌细胞模型,通过转录组测序与WGCNA分析探索MERRF心肌损伤的新机制。方法 将MERRF患者的PBMC重编程而来的iPSC体外定向分化为心肌细胞,通过免疫荧光染色、RT-PCR等对心肌细胞进行鉴定;通过电镜观察不同突变率的心肌细胞的亚显微结构,提取突变率最低和最高的两组iPS细胞系及相应的心肌细胞的RNA,进行转录组测序与WGCNA分析,根据测序及分析结果挑选相关的重要基因进行qPCR验证。结果 4组MERRF患者来源的iPS细胞均成功分化为搏动的心肌细胞,免疫荧光染色及RT-PCR鉴定发现所得的心肌细胞正常表达心肌标志基因。高突变率的心肌细胞与低突变率的心肌细胞相比,电镜下线粒体破碎、肿胀,且心肌搏动频率较低。转录组测序结合WGCNA分析,富集到一些与心肌发育,肌肉分化,心肌细胞收缩等相关的基因与信号通路分子,这些相关的基因与信号在突变率最高的M4-CMs中与突变率最低的M1-CMs中的表达量有明显差异,qPCR实验验证了多条重要基因的变化趋势与测序的结果保持一致。结论 成功将MERRF患者来源iPSC分化为心肌细胞,并且该心肌细胞是能够用于疾病研究的良好模型与良好对照系。WGCNA及qPCR实验发现若干与心肌发育相关的差异基因及信号通路,为深入探索MERRF心肌损伤的分子机制提供信息,也为将来该疾病心肌损伤的治疗提供了潜在靶点。目的 建立三种常见遗传病(PKU,Williams syndrome,T21)的iPSC疾病模型,通过转录组测序与WGCNA分析在iPS水平探索这三种遗传病的发病机制,为以后遗传病的早期干预和治疗提供依据。方法 收集PKU患者、Williams综合征患者的PBMC,T21胎儿的AFC,用含有Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc4种转录因子的仙台病毒感染PBMC和AFC进行重编程并获得相应患者来源的iPS细胞系。通过免疫荧光染色、RT-PCR、拟胚体分化等方法鉴定各iPS细胞系的多能性。对PKU患者来源的iPS进行桑格测序,对Williams综合征患者来源的iPS进行染色体芯片分析,对21三体综合征患者来源的iPS进行核型分析,判断所得iPS细胞是否保留了相关的遗传缺陷。将这三种疾病来源的iPS细胞系及对照进行转录组测序与WGCNA,挑选与疾病相关的重要基因进行q PCR验证。结果 分别获得了这三种遗传病的iPS细胞系,免疫荧光染色、RT-PCR、拟胚体体外分化实验的结果表明各iPS细胞系均具有多能性。桑格测序结果表明PKU患者来源的iPS细胞与患者原代细胞的PAH基因突变点一致,基因芯片分析结果表明Williams综合征患者来源的iPS细胞与患者原代细胞7号染色体缺失区域及大小保持一致,核型分析表明21三体综合征患者来源的iPS细胞核型仍为21三体。WGCNA发现T21-iPS特异性表达的模块富集到与造血祖细胞分化等相关的条目,而PKU-iPS及Williams-iPS特异性高表达的模块富集到一些与轴突、神经元等发育相关的条目。qPCR验证结果与测序的结果多数保持一致。结论 成功建立了PKU,Williams综合征及T21的iPS疾病模型,验证结果表明这些iPSC具有多能性,并能够保留相应疾病的遗传学缺陷。WGCNA及q PCR结果发现与白血病相关的GATA3基因,在T21-iPS中特异性高表达,与神经发育过程有关ERBB2和LEF1基因在Williams综合征中呈高表达,表明在iPS水平就能较早的检测出疾病相关表型。该模型为深入研究这些遗传病的分子机制提供了良好的平台。