背景和目的：近年来肿瘤微环境和干细胞对肿瘤的影响日益受到人们的关注。其中肿瘤干细胞学说的提出和肿瘤相关成纤维细胞研究的日益深入大大推动了人们对肿瘤发生发展机制的认识。肿瘤周围和系统性的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肿瘤的归巢及其向肿瘤干细胞和/或肿瘤相关成纤维细胞表型转化及其功能改变的研究是当下的热点之一,MSCs对肿瘤的促进或抑制作用目前尚无定论,特别是MSCs对口腔鳞癌的影响鲜有研究。本研究通过平板克隆实验、CCK8细胞增殖实验、Transwe11迁移实验和Transwell侵袭实验等体外实验探讨(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)对舌鳞癌(tongue squamous cells carcinoma, TSCC)细胞系生物学行为的影响,同时,建立TSCC裸鼠皮下移植瘤动物模型,尾静脉注射携带绿色荧光蛋白标记的BMSCs,通过测量肿瘤体积、荧光显微镜观察、组织学观察以及免疫组化染色等方法探讨BMSCs在体内向TSCC移植瘤模型组织的迁移及对移植瘤模型生物学行为的影响。材料与方法1、BMSCs对舌鳞癌细胞系CAL27生物学行为的影响1.1舌鳞癌细胞系CAL27和BMSCs的共培养培养舌鳞癌细胞系CAL27和BMSCs至对数生长期,舌癌细胞用1640完全培养基重悬并计数,使细胞密度达到2.5×105个,加入至6孔板中。BMSCs用]BMSCs培养基重悬并计数,使细胞密度达到1.5×105个,加入到Transwell系统的上室中。1.2平板克隆实验实验分为两组：共培养组和对照组。共培养组中,舌鳞癌细胞共培养24h后,以每皿1×104个舌鳞癌细胞密度接种于细胞培养皿中,每2天补加100u1共培养的上清液,对照组加等量的单独培养的舌癌细胞和舌癌细胞上清液。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养,多聚甲醛固定,结晶紫染色,直接计数克隆,比较克隆形成的大小和数目。1.3 CCK8增殖实验实验分为两组：共培养组和对照组。共培养组中：舌鳞癌细胞共培养24h后,以每孔1000个细胞种到96孔板中,每隔24h加20u1共培养的上清液；对照组加等量的单独培养的舌癌细胞和舌癌细胞上清液,每隔24h检测一次细胞活力,检测前每孔加10ul CCK8试剂,37℃培养箱中孵育1.5h,使用酶标仪用450nm激发光检测0D值,绘制增殖曲线。1.4 Transwell迁移实验实验组中将共培养24h的舌癌细胞1×104个加入小室中,下室中加入10%FBS培养液。对照组中上室加入等量的单独培养的舌癌细胞,下室中加入10%FBS培养液。两组上室均使用无血清培养液,其他培养条件一致,24h后多聚甲醛固定,结晶紫染色,切下基底膜置于载玻片上观察,随机选取5个清晰的视野,拍照,计数。1.5 Transwell侵袭实验将transwell小室至于24孔板中,加入稀释后的Matrigel基质胶,水化基底膜,将共培养24h的细胞消化,使用无血清培养基制成细胞悬液,每个小室中加入100u1,使细胞个数为1×104个。下室中加入600u1的10%FBS培养液；对照组中上室加入等量的单独培养的舌癌细胞,下室中加入10%FBS培养液,保持两组间的培养条件一致,多聚甲醛固定,结晶紫染色,切下基底膜置于载玻片上观察,随机选取5个清晰的视野,拍照,计数。2、BMSCs对舌鳞癌移植瘤生物学行为的影响的体内研究2.1舌鳞癌移植瘤模型的建立本实验采用贴壁法培养人舌鳞癌细胞,当体外扩增的细胞量达到移植标准时,将细胞消化移入离心管,1000rpm离心5min,弃上清液,加入DMEM高糖培养基制成细胞悬液,并调节细胞密度至1×107个／mL。5周龄健康雄性BALB/c裸小鼠,18只,适应1周后,随机取其中12只裸小鼠,以密度1×107个舌鳞癌细胞(注射剂量为0.2 mL)注射于每只裸鼠近左腋部皮下,每天用游标卡尺分别测量裸鼠肿瘤的长径(a)及短径(b),长度单位为mm,肿瘤体积计算公式为V=1/2ab2,当平均组内瘤体积达到50mm3时,为达到成瘤标准。裸鼠成瘤后,将12只荷瘤裸小鼠随机分为两组：TSCC组和TSCC+BMSC组。未注射舌癌细胞的6只健康裸小鼠为BMSC组,共3组,各6只裸鼠。2.2 BMSCs向舌鳞癌移植瘤的迁移培养BMSCs,当细胞融合度达到80%-90%时,给细胞传代,利用携带GFP基因的慢病毒载体感染BMSCs,并于体外扩增,数量级达到移植要求。于肿瘤达到成瘤标准后,取生长旺盛的GFP标记的BMSC细胞,调节细胞密度为5×106个/mL,用1mL注射器缓慢注入TSCC+BMSC组和BMSC组小鼠尾静脉,每只小鼠注射0.2mL。4周后处死裸鼠,解剖出肿瘤分两份,一份置于液氮中保存,另一份用福尔马林溶液固定,做石蜡切片。从液氮中取出冷冻的移植瘤组织进行组织切片,于荧光显微镜下检测GFP的表达。用Abeam公司的兔单克隆抗体GFP抗体作为一抗,按试剂盒说明书的方法对组织进行免疫组化检测GFP的表达情况。2.3 BMSCs对舌鳞癌移植瘤生长的影响观察尾静脉注射BMSCs后裸鼠肿瘤生长情况和体重变化情况,每两天测量一次裸鼠肿瘤体积及裸鼠体重,按照文献上报道的方法(V=1/2ab2,V为肿瘤体积,a为长径,b为短径)计算肿瘤体积大小并进行统计学分析。并对各组肿瘤组织的分化类型进行统计学分析。体内免疫组化实验按试剂盒说明书对TSCC组、TSCC+BMSC组舌癌组织中与细胞增殖密切相关的指标Ki67, c-myc和PCNA的表达进行检测。先进行二甲苯脱蜡和水化,然后参照一抗说明书进行抗原修复,阻断内源性过氧化物酶,滴加适量一抗、适量辣根酶标羊抗兔IgG聚合物和适量DAB显色剂,苏木精复染后冲洗,脱水,透明,封片。用PBS代替一抗作为阴性对照,无特异性染色者为阴性,细胞或组织呈特异性棕黄色染色者为阳性。对免疫组化实验结果进行统计学分析。结果：1、BMSCs对舌鳞癌细胞系CAL27生物学行为的影响的体外研究1.1平板克隆实验：培养两周后,共培养组的细胞克隆数目多于对照组,且差异有统计学意义(P=0.033<0.05),说明CAL27舌癌细胞与BMSCs共培养后增殖能力增加。1.2 CCK8增殖实验：实验结果显示：共培养组和对照组在0h(P=0.729>0.05)和24h(P=0.890>0.05)差异无统计学意义；在48h(P=0.025<0.05)和72h(P=0.004<0.05),共培养组增殖高于对照组,差异有统计学意义。1.3 Transwell迁移实验：共培养组细胞迁移到小室下表面的数量多于对照组,两组间差异显著(P=0.001<0.05),说明共培养后,癌细胞的迁移能力变强。1.4Transwell侵袭实验：在侵袭实验中,共培养组舌鳞癌细胞将基质胶分解后运动到小室下表面细胞多于对照组,且差异显著(P=0.002<0.05),说明共培养后,癌细胞的侵袭能力变强。2、BMSCs对舌鳞癌移植瘤生物学行为影响的体内研究2.1舌鳞癌移植瘤动物模型的建立培养的舌鳞癌细胞高倍镜下核异常分裂象多见,说明舌癌细胞增殖非常活跃。于裸鼠近左腋部处皮下注射舌鳞癌细胞系CAL27后,1周后在左腋部皮下可见膨隆,2周后可触及质硬的结节性肿块,后肿瘤逐渐增大,裸鼠移植瘤的大小与生长时间成正比,随时间增长而增大。3周达到成瘤标准,成功建立裸鼠舌癌移植瘤动物模型。2.2静脉注射的BMSCs向舌鳞癌移植瘤的迁移培养的BMSCs为均质的、细长的、典型的成纤维细胞形态,呈漩涡状生长。携带GFP慢病毒感染BMSCs后可观察到绿色荧光表达,GFP随细胞传代稳定表达。将BMSCs缓缓注入裸鼠尾静脉。4周后,处死裸鼠。解剖学发现,肿瘤包膜完整,表面光滑,与周围组织分界清楚,与背部皮肤、肌肉组织无明显粘连,形状多不规则,表面结节状,腋下及腹股沟淋巴结未见明显肿大。剥离时大部分肿瘤组织与周围组织无粘连,肿瘤表面有破溃的瘤体在破溃处与周围组织粘连,不易分离。显微镜下可见组织结构异型性：癌细胞呈巢团状排列,在间质中呈浸润性生长,中心区域可见角化珠。也可见癌细胞异型性：癌细胞排列拥挤,无极性,细胞异型性明显,核大深染,大小不一,病理性核分裂像可见。淋巴结及主要脏器肺、肝等器官未见转移灶。在荧光显微镜下观察,在TSCC+BMSC组肿瘤组织中可见绿色荧光,而在TSCC组肿瘤组织中未见绿色荧光。免疫组织化学实验发现,在TSCC+BMSC组,GFP抗体定位于肿瘤组织和肝脏组织中,未在肺脏组织中发现。而在未注射BMSC的TSCC组,在肿瘤组织、肝脏和肺组织中均未见GFP。说明BMSCs可迁移至舌癌组织中。2.3 BMSCs对舌鳞癌移植瘤生长的影响注入BMSCs 4周后我们发现：BMSC组裸鼠体重增加明显,TSCC组次之,BMSC+TSCC组裸鼠体重增加不明显,BMSC+TSCC组和TSCC组裸鼠体重增加无显著差异(P＞=.05)。移植BMSCs后的前15天,肿瘤大小无统计学差异(P＞0.05),从第16天开始,BMSC+TSCC组肿瘤增长较快,较TSCC组差异有统计学意义(P＜0.05)。说明BMSCs促进舌癌生长。免疫组织化学染色发现Ki67, c-myc和PCNA表达在TSCC细胞核中,统计学分析发现,TSCC+BMSCs组表达较TSCC组强(P＜0.05)。说明BMSCs促进舌癌细胞的增殖。结论：1、成功建立舌鳞癌动物模型。在CAL27舌鳞癌细胞接种量、接种部位、动物周龄及状态等内外部条件适宜情况下,成瘤率可达100%。2、BMSCs能促进舌癌细胞迁移并且能迁移至舌癌组织中。我们发现在裸鼠的移植瘤、肝脏中均有GFP表达,说明GFP不是选择性的仅迁移至移植瘤中,其也可迁移至其他脏器中。但在肺组织中未发现GFP表达,其确切机制有待于进一步研究。3、BMSCs在体外能促进舌癌细胞的增殖和侵袭,在体内能促进舌癌的生长和舌癌细胞的增殖。注射BMSCs后,BMSC+TSCC组肿瘤增长较快,同时与细胞增殖密切相关的指标Ki67, C-myc和PCNA表达升高。