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研究背景糖尿病的多种并发症与组织缺血所致的延迟修复有关,是影响糖尿病患者生活质量和预后的重要因素。组织缺血后的修复是一个涉及到多种细胞和分子参与的复杂过程,其中血管新生起着重要的作用。血管新生受到来自周围微环境的正向和负向调控信号的严密调控,但这种平衡在糖尿病状态时发生改变,导致糖尿病患者某些器官缺血之后的血管新生受损,从而引起组织修复的延迟。因此,恢复正常的血管新生功能已成为治疗糖尿病患者并发症的一种很有潜力的治疗策略。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）是在血管新生中起着关键作用,它的作用包括两个方面,一是通过分泌促血管生成的调控因了促进血管新生,二是直接整合到新生血管网状结构中参与血管生成。近年来,EPCs的细胞治疗已经成为具有潜在临床价值的治疗糖尿病血管并发症的重要策略。然而,临床研究结果表明,糖尿病患者自体细胞移植的疗效低于非糖尿病患者,其原因是糖尿病患者体内的EPCs功能已明显受损,但到目前为止,糖尿病EPCs功能受损的分子机制仍未阐明。因此,进一步明确糖尿病EPCs功能受损的分子机制,寻求改善EPCs功能的方法,对于治疗糖尿病并发症具有重要的临床意义。最近,microRNAs （miRNAs）作为新的血管新生的调节因子日益受到重视,已证实miRNA let-7f可促进成熟内皮细胞所介导的血管新生,但miRNA let-7f对于调节糖尿病EPCs功能的作用和机制尚未见报道。我们的前期实验发现,let-7f在EPCs中有很高的表达,且可调节EPCs内AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）的活性和衔接蛋白p66shc的蛋白表达水平。因此,本课题旨在探讨miRNA let-7f对糖尿病EPCs功能的调节作用,并探讨AMPK和p66shc在let-7f调节EPCs功能中所起的作用。研究目的1.研究niRNA let-7f在1型糖尿病小鼠EPCs中的表达变化及其对糖尿病EPCs功能的调节作用；2.研究AMPK对1型糖尿病小鼠EPCs功能的调节作用及其机制；3.探讨AMPK和p66shc在let-7f调节EPCs功能中所起的作用。研究方法1.动物模型野生型（wild-type） C57BL/6雄性小鼠（8-10周龄）,连续五天腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）,对照组小鼠腹腔注射枸橼酸钠缓冲液。末次注射后3-4天测定血糖浓度,筛选出血糖在280 mg/dL以上者作为1型糖尿病动物模型,之后隔天监测血糖,待血糖持续升高4-6周后用于实验。2. EPCs的分离培养及鉴定无菌分离实验小鼠股骨、胫骨、髋骨及肱骨,收集骨髓单个核细胞。将细胞按照1×106/cm2的密度接种在已包被玻连蛋白（vitronectin）的六孔板中,置于37℃,5% CO2中培养。培养4天后第一次完全换液,以去除未贴壁的细胞后继续培养3天,即可用于实验。为了鉴定EPCs,细胞培养7天后,用Dil-acLDL、isolectin和Hoechst 33258进行染色并在荧光显微镜下观察。为了进一步鉴定EPCs,对培养7天的细胞采用流式细胞术分析其表面干细胞表面标记物Sca-1和CD34、内皮细胞表面标记物VEGFR2 （Flk-1）和VE-Cadherin （CD 144）及单核细胞表面标记物CD11b的表达,并与新鲜分离的骨髓单个核细胞进行比较。3. EPCs的功能检测通过检测小管形成试验（tube formation assay）、细胞黏附试验（adhesion assay）和细胞迁移实验（migration assay）检测EPCs的小管形成能力、黏附能力及迁移能力。4. Real-time PCR使用mirVanaTM miRNA提取试剂盒提取EPCs中的miRNAs,并用Taqman microRNA反转录试剂盒进行反转录,最后使用Taqman miRNA引物和TaqMan Universal PCR Master Mix检测EPCs中let-7f的表达,并以snoRNA55作为内参照。5. Western Blot利用特异性的抗体检测EPCs内p-thr172-AMPK、p-ser79-ACC、MnSOD、PP2A以及p66shc的蛋白表达,在Odyssey图象分析仪上扫描,并用Quantity-One图象分析软件进行条带灰度扫描计算积分光密度值。6.Let-7f模拟物、抑制物和siRNAs的转染利用DharmaFECT （?）专染试剂Ⅰ对EPCs分别转染let-7f模拟物、抑制物、MnSODsiRNA、PP2AsiRNA以及各自的随机对照。7.腺病毒的转染分别用50MOI的Ad-AMPK-DN转染EPCs抑制AMPK的活性,用10MOI Ad-p66shcRNAi转染EPCs抑制p66shc的蛋白表达,并以Ad-β-gal转染作为对照。8. MnSOD活性的测定利用SOD活性检测试剂盒检测EPCs内MnSOD的活性。9.线粒体内ROS的检测用MitoSOX线粒体氧自由基荧光探针对EPCs进行孵育,然后用流式细胞术进行定量以检测EPCs线粒体内的ROS含量。结果1. MiRNA let-7f在1型糖尿病小鼠EPCs中的表达水平显著降低,降低血糖可恢复其表达。与正常对照组小鼠分离培养的骨髓EPCs相比,1型糖尿病小鼠EPCs中miRNA let-7f的表达水平明显降低,应用胰岛素治疗降低糖尿病小鼠血糖后,let-7f表达水平升高,而晚期糖基化终末产物、Ly83583和过氧化氢作用于EPCs后对let-7f的表达水平无影响。2. MiRNA let-7f改善1型糖尿病小鼠EPCs受损的功能。通过let-7f模拟物转染糖尿病EPCs使let-7f在细胞内过表达,糖尿病EPCs受损的功能明显改善,表现为小管形成能力、黏附能力和迁移能力的增加。相反,在正常EPCs中转染let-7f抑制物后let-7f的正常表达被抑制,正常EPCs形成小管的能力、黏附能力和迁移能力明显下降。3. AMPK通过上调MnSOD而起到保护1型糖尿病EPCs功能的作用。Western Blot的结果表明,1型糖尿病小鼠EPCs中AMPK的活性降低,应用AMPK特异性激活剂AICAR后可恢复EPCs的功能,上调糖尿病EPCs中已降低的MnSOD活性,并抑制线粒体内活性氧的产生。在用AIACR处理糖尿病EPCs之前,先用MnSODsiRNA转染抑制EPCs内MnSOD的表达,发现AICAR恢复EPCs功能的作用显著减弱。4.抑制1型糖尿病EPCs中的PP2A可增加细胞内AMPK的活性。Western Blot结果显示,对AMPK （?）舌性有抑制作用的蛋白磷酸酶2A（Protein phosphatase 2A,PP2A）在1型糖尿病小鼠EPCs中的表达升高,用PP2AsiRNA和PP2A抑制剂软海面酸作用于糖尿病EPCs后,降低的AMPK活性得到提高,继而MnSOD的蛋白水平也有所回升。5. AMPK参与介导了miRNA let-7f对糖尿病EPCs功能的调节。首先,糖尿病小鼠EPCs中过表达let-7f可恢复细胞内降低的AMPK活性,而抑制let-7f的表达则可显著降低正常EPCs中AMPK的活性。let-7f对EPCs功能的改善作用可以被编码功能负突变的AMPK的腺病毒载体（Ad-AMPK-DN）部分抑制。6.p66shc参与介导miRNA let-7f对EPCs功能的调节。1型糖尿病小鼠EPCs中p66shc的蛋白水平升高,let-7f的过表达可抑制糖尿病小鼠EPCs中p66shc的蛋白表达。用Ad-p66shcRNAi转染糖尿病EPCs后抑制其中p66shc的蛋白水平,可显著改善糖尿病EPCs的功能障碍。Ad-p66shcRNAi转染还可部分抑制由let-7f表达不足而导致的EPCs功能障碍。结论1. MiRNA let-7f对改善1型糖尿病小鼠EPCs的功能有重要作用,调控EPCs中let-7f的表达可能是增强EPCs疗效的有效策略。2. AMPK可通过上调糖尿病EPCs中MnSOD的蛋白水平和活性而抑制活性氧的产生,从而改善EPCs的功能。3. AMPK和p66shc参与miRNA let-7f对1型糖尿病小鼠EPCs功能的调节作用。