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目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种慢性脱髓鞘疾病,多由中枢神经系统(central nervous system,CNS)炎症和自身免疫功能障碍引起,通常导致患者严重的终身残疾。目前没有可以治愈MS的方法,治疗主要依靠疾病修饰药物和对症治疗药物,减慢疾病进展从而减少疾病复发和严重程度。干细胞治疗在临床研究和多种疾病模型中均被证实能有效减轻神经系统损伤,减缓疾病的进展。最近的研究表明,外泌体参与的旁分泌作用可能是干细胞发挥效应的主要途径,骨髓间充质干细胞的外泌体在许多自身免疫性疾病和组织损伤中发挥着治疗作用。小胶质细胞作为CNS的免疫监视细胞,其M1/M2表型相互转化的比例失衡,参与MS的发生发展,影响疾病进程。本研究采用骨髓间充质干细胞的外泌体治疗MS动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型,探讨外泌体治疗对疾病大鼠行为学评分和CNS病理改变的影响,以及治疗前后脊髓内小胶质细胞M1/M2两种表型比例的数量变化,明确外泌体是否影响小胶质细胞极化进而减轻MS的严重程度。探讨小胶质细胞极化在外泌体治疗EAE模型中的作用及分子机制,为改善自身免疫性疾病和治疗炎性疾病提供一种极具前景的方法。研究方法:本研究首先采用全骨髓贴壁法分离提取原代大鼠骨髓间充质干细胞,并进行干细胞性质的鉴定。采用超速离心法从骨髓间充质干细胞的培养上清中提取外泌体并鉴定,用于后续的功能实验。在此基础上在EAE大鼠疾病模型中采用尾静脉注射外泌体治疗,评估外泌体对疾病模型的在体治疗效果。此后,本研究采用体外细胞实验,分别将骨髓间充质干细胞和干细胞的外泌体与小胶质细胞进行共培养,应用免疫荧光和实时定量PCR的方法检测小胶质细胞表型转化相关蛋白和mRNA的表达情况,判断干细胞外泌体是否通过调节小胶质细胞免疫炎症反应,参与多发性硬化发病的病理过程。最后,采用蛋白质组学labelfree的方法检测外泌体治疗影响小胶质细胞表型转化过程的分子机制,并通过平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)对蛋白组学的结果进行初步验证。结果:1、成功分离提取大鼠骨髓间充质干细胞,其形态和表面标志物表达符合间充质干细胞特征,并具有多向分化能力。在此基础上成功提取骨髓间充质干细胞的外泌体,直径在30-100nm之间,其表面表达CD9、CD63、Alix特异性分子标志物。2、骨髓间充质干细胞外泌体对EAE大鼠的疗效评估,与EAE组大鼠相比,外泌体处理显著降低神经行为评分,减轻体重下降程度;HE染色结果提示外泌体治疗组脑组织炎性细胞浸润减少,LFB染色结果提示外泌体治疗组脊髓脱髓鞘情况减轻;治疗后,大鼠血浆中抗炎性细胞因子表达升高,促炎性细胞因子表达降低。与EAE组相比,外泌体处理组M2表型标志物的蛋白表达水平和mRNA水平显著增加,而M1相关标志物蛋白水平和mRNA水平降低。说明干细胞外泌体不仅可以减轻CNS炎症和脱髓鞘情况,还可以对中枢和外周免疫环境产生调节作用。3、体外实验结果显示,干细胞外泌体处理后的小胶质细胞M2相关标志物的mRNA表达水平升高,M1相关标志物的mRNA表达水平降低,促炎性细胞因子分泌减少,抗炎性细胞因子分泌增加。经干细胞外泌体处理后,小胶质细胞倾向于向M2表型转化。4、经过label-free蛋白质组学检测,外泌体处理后的小胶质细胞与处理前存在7个差异蛋白(在任意一组不为空值,差异倍数>1.5,P<0.05),用PRM方法对label-free的结果进行靶向验证,证实有5个目标差异蛋白(Acadv1、Aarsd1、Acad9、RT1.a1(f)、Ehd1)蛋白质,在外泌体处理前后LPS激活的小胶质细胞中确实存在表达的差异。结论:1、本研究成功提取大鼠骨髓间充质干细胞并分离出其培养上清中的外泌体,同时对外泌体进行了蛋白定量。2、骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以缓解EAE大鼠的疾病进展,改善大鼠体内的免疫环境,减轻脑组织炎性细胞浸润和脊髓的髓鞘脱失。3、骨髓间充质干细胞外泌体在体内外可以诱导小胶质细胞向M2表型极化,发挥免疫调节作用。4、骨髓间充质干细胞外泌体通过影响5个差异蛋白的表达,诱导小胶质细胞向M2表型转化,改善EAE大鼠发病的严重程度。