梅山猪是我国优秀地方猪种,是国内外猪遗传育种的重要品种资源,其重要功能基因的克隆、分析鉴定和生物学特性研究有助于积累和开发利用我国重要地方猪种的基因资源信息,为优良猪种的遗传改良提供理论依据。Patatin作为进化中保守的结构域在脂肪代谢中起重要作用。最近发现的人PNPLAs(patatin-like phospholipases)家族中PNPLA2、3、4在脂肪合成和分解代谢中有重要作用。但是目前未见有关猪PNPLA3、4基因的研究报道。为了深入了解猪PNPLA3、4在脂肪代谢中的生物学功能,本文以梅山猪为研究对象,克隆了PNPLA3、PNPLA4基因及其选择性剪接体,利用辐射杂种板技术和电子定位技术确定了其染色体定位,并采用实时定量PCR等方法分析了其组织表达谱。为了解猪PNPLA3的表达调控机制,本文利用瞬时转染转录因子KLF15的猪肾细胞系,通过实时定量PCR测定PPARγ,和PNPLA3 mRNA的表达差异,并利用油红O染色法检测猪肾细胞积累脂肪含量的变化。本文的主要研究结果如下:1.扩增得到梅山猪PNPLAs家族PNPLA3 cDNA序列和PNPLA4含全长编码区的cDNA序列,并对其进行了DNA和氨基酸序列分析。本实验扩增得到的猪PNPLA3 cDNA2555 bp,编码区全长为1326bp,编码441个氨基酸;在蛋白质水平上,本实验获得的猪PNPLA3氨基酸序列与人(NP 079501)、小鼠(NP 473429)、大鼠(XP 343302)的PNPLA3的同源性依次是61.5%、55.2%、57.2%。扩增得到猪PNPLA4 cDNA 819 bp,包括全长编码区771 bp,编码256个氨基酸;在蛋白水平上,与人的PNPLA4(NP 001135861)有61.5%的同源性。2.实验结果证实在猪中存在PNPLA4的一个差异剪接体,相对于野生型全长PNPLA4 variant1命名为PNPLA4 variant2,得到包含705bp全长编码区的753bp的cDNA序列,编码234个氨基酸,它是由野生型PNPLA4 variant1完全缺失第四个外显子66bp所产生。这种剪接方式可能只存在于猪中。通过RT-PCR定性检测发现PNPLA4 variant2除了在肺、脂肪和大脑中没有检测到外,在其他组织中都有表达,但是表达量低于PNPLA4 variant2。3.通过辐射杂种板技术将猪PNPLA3基因定位在5p11-15。通过电子定位技术将猪PNPLA4定位于Xp24。并且通过比对猪-人比较基因组图谱证实这两个基因的定位结果与人相应基因在染色体上的位置相对应。4.通过实时定量PCR的方法研究了猪PNPLA3、4基因在mRNA水平上的组织表达谱。结果表明猪PNPLA3、4表达的组织特异性较强,猪PNPLA3在脂肪和肝中高量表达,在心脏、肺和肾脏中低表达,在脾、肠、大脑中几乎检测不到表达。猪PNPLA4基因表达除在肝中表达量比较高心中有表达以外,在其他组织中表达量很低。5.以遗传脂肪型猪(通城猪)和遗传瘦肉型猪(大白猪)的组织样品为材料,对mRNA水平上PNPLA3在两种不同类型猪中的组织表达差异进行了研究。结果显示PNPLA3基因在通城猪肝脏中表达量显著低于大白猪的相应组织,在脂肪组织中差异不显著。6.使用已有KLF15的真核表达载体(PcDNA3.1-KLF15表达载体)和PcDNA3.1空载体转染IBRS-2细胞24hrs后,油红O染色法检测脂肪积累变化,实时定量PCR检测PPARγ和PNPLA3 mRNA水平的变化。结果表明KLF15促进IBRS-2细胞脂肪积累,显著上调PPARγ和PNPLA3 mRNA的表达,推测KLF15可以调控PNPLA3的表达。