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目前,针对慢性粒细胞白血病(CML)靶向作用于Bcr-Abl融合基因的酪氨酸激酶抑制剂的研发及上市,使得CML的治疗发生了革命性进展。作为第一代酪氨酸激酶抑制剂,伊马替尼(Imatinib)明显地改善CML患者的疗效及预后,然而随着治疗过程逐渐出现了耐药性。对此研发了第二代酪氨酸激酶抑制剂尼洛替尼及达沙替尼等,但对T315I突变依旧无效,同样在胃肠道间质瘤(GIST)的治疗过程也出现了Imatinib耐药的情况。因此,研发新型的小分子靶向药物来解决Imatinib耐药的问题成了目前研究的重点。本课题研究的新型小分子化合物普环替尼(CY03529B)是在结合计算机辅助药物设计理论思想,分析蛋白的结构及作用方式,通过药物设计手段得到的全新母核结构的化合物。本文旨在研究CY03529B对Imatinib耐药的慢性粒细胞白血病K562/G01细胞株及胃肠道间质瘤GIST-1210细胞株的抗肿瘤活性及其作用机制。本文首先采用MTT法测定肿瘤细胞的生长曲线及细胞的对数生长期,检测两种肿瘤细胞的耐药倍数,其中K562/G01细胞的耐药倍数为9.35倍,GIST-1210细胞的耐药倍数为6.18倍,根据体外的肿瘤细胞增殖抑制率来绘制了两种耐药细胞的量效曲线,进一步检测了化合物对其他常见肿瘤细胞的选择性。通过MSA方法检测了CY03529B对Bcr-Abl和c-Kit以及其多种突变激酶的抑制作用,结果显示在1μM浓度下CY03529B对两种激酶及其相关突变激酶均有较强的抑制作用。通过软琼脂克隆形成试验检测了CY03529B对耐药肿瘤细胞K562/G01及GIST-1210细胞的集落形成率的影响,结果显示CY03529B对K562/G01细胞的集落形成抑制率为达到100%,对GIST-1210细胞的集落形成抑制率为97.7%,明显优于同浓度下Imatinib。通过划痕试验中划痕的愈合程度考察CY03529B对GIST-1210细胞的迁移能力影响,结果显示CY03529B可明显抑制GIST-1210细胞的迁移能力,并具有时间和浓度依赖性。基于上述体外抗肿瘤活性试验,我们进一步检测CY03529B体内的抗肿瘤作用,建立了耐药的人源性慢性粒细胞白血病NOD/SCID小鼠模型,实体瘤体积达到160mm~3以上后,连续CY03529B给药24天,CY03529B给药组小鼠体内实体瘤体积明显变小。100mg/kg、50mg/kg剂量组对肿瘤的抑制作用均明显优于Imatinib 100mg/kg剂量组,且未出现小鼠死亡或者体重明显下降。体内试验结果与体外活性结果基本一致,说明CY03529B对耐药肿瘤细胞具有良好的体内外活性及良好的体内安全性。进一步研究CY03529B对耐药肿瘤细胞K562/G01和GIST-1210细胞的作用机制,我们首先通过AO-EB双染色法观察CY03529B对细胞形态学的影响,结果显示CY03529B可以诱导两种耐药肿瘤细胞凋亡。通过流式细胞术(FCM)定量检测法,检测CY03529B对两种耐药肿瘤细胞的凋亡的影响,CY03529B对K562/G01细胞及GIST-1210细胞的凋亡率明显的高于优于阳性药Imatinib组,并与AO-EB染色结果一致。采用流式细胞术检测给药后耐药肿瘤细胞周期变化。研究结果显示,CY03529B干预后,将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增殖,而且作用效果优于Imatinib,并呈浓度依赖性。并通过RT-PCR试验证明了CY03529B对诱导凋亡相关基因Caspase-3和Caspase-8基因的表达量有明显的上调作用,并同时下调Bcr-Abl与c-Kit基因抑制细胞的增殖。同时,Western Blot试验发现了CY03529B一方面可以抑制Bcr-Abl蛋白与c-Kit蛋白的表达,另一方面对细胞内信号通路具有调节作用。总之,试验结果显示CY03529B对伊马替尼耐药的K562/G01细胞株、GIST-1210细胞株有很好体内外抗肿瘤活性,作用机制为通过诱导肿瘤细胞凋亡,阻滞于G0/G1期,下调致病基因与致病蛋白,并上调凋亡基因Caspase-3和Caspase-8,抑制P-STAT5及P-Crkl的磷酸化。上述研究成果为后续应用于临床研究,开发出更加安全有效的Imatinib耐药的新型酪氨酸激酶抑制剂提供理论依据。