结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在我国发病率仅次于肺癌和乳腺癌，是排名第三的恶性肿瘤。因其低至11%的早期诊断率和高达20%-45%的术后复发或远处转移率，使其死亡率高居第四位。结直肠癌起源于一系列遗传和表观遗传的变化，DNA甲基化是表观遗传修饰的主要机制。目前，其主要治疗手段包括手术治疗、放疗、化疗和靶向治疗等，尽管近年来上述治疗措施己取得长足进步，但其复发率和病死率仍很高，总体疗效差，主要原因在于其发病、复发及转移等相关机制尚不明确。目前影像学、肿瘤标志物和病理学在预测复发和转移方面并不尽如人意，影像学检查昂贵费时且发现时较晚，肿瘤标志物则具有滞后性且灵敏度和特异度都较低，而病理学侵入性取样且受病灶位置所限等。因此，结直肠癌研究的一个重要目标就是找到可以方便准确预测复发和转移的生物标记物。血液游离DNA可为结直肠癌的早期诊断、疗效评估、复发监测及预后判断提供重要的信息，且非侵入性，可以多次便捷取样实现实时监测，被称为"液体活检"。被认为是一个潜在的结直肠癌早期诊断和预后判断手段。主要研究通过血液游离DNA的CpG岛表型甲基化分析研究肿瘤的可行性。　　实验共分为两个部分：第一部分，比较4种试剂盒对血浆游离DNA的提取效果，选择最佳的试剂盒用以血浆游离DNA的提取；第二部分，CpG岛甲基化表型（CIMP）结直肠癌新的分子标记物鉴定和临床病理特征研究，并评估血液游离DNA中CpG岛表型甲基化分析能否指导结直肠癌的早期诊断和预后判断。　　第一部分 4种血浆游离DNA提取试剂盒的比较　　目的：　　比较TIANamp Virus DNA/RNA Kit、TIANamp Micro DNA Kit、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extration Kit和ZR Serum DNA Kit4种试剂盒对血浆游离DNA的提取效果，选择最佳的试剂盒用以血浆游离DNA的提取。　　方法：　　首先，建立稳定的血浆游离DNA测量方法。将人基因组DNA经紫外分光光度法准确定量并梯度稀释后建立标准曲线，再将分别用4种试剂盒提取的血浆游离DNA进行实时荧光定量PCR检测，用标准曲线换算各种试剂盒提取的浓度值；其次，通过建立含有一定浓度GFP DNA的血浆，分别采用4种试剂盒提取，并用实时荧光定量PCR技术检测GFP DNA的含量，再具体从提取效率、相对丢失率和相对抑制率三个方面对4种试剂盒的提取效果作全面的评价；最后，向血浆中加入含不同大小DNA片段的DNA Marker，检测试剂盒对不同大小片段尤其是小分子片段的提取效果。　　结果：　　TIANamp Virus DNA/RNA Kit、TIANamp Micro DNA Kit、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extration Kit和ZR Serum DNA Kit提取血浆游离DNA的平均值分别为(32.0±1.4)ng/ml、(34.7±5.4)ng/ml、(24.1±3.9)ng/ml、(13.5±5.1)ng/ml，变异系数分别为4.5%、15.0%、16.2%、27.5%，提取效率分别为：80%、74%、68%、65%，相对丢失率为：19%、22%、30%、32%，相对抑制率为：2%、6%、11%、15%，从以上结果以及对不同大小片段提取效果的半定量结果综合评价TIANamp Virus DNA/RNA Kit和TIANamp Micro DNA Kit提取效果优于其他试剂盒(P＜0.05)。　　结论：　　TIANamp Virus DNA/RNA Kit和TIANamp Micro DNA Kit能够有效提取血浆游离DNA，优于所选择的其他试剂盒，适合用于血浆游离DNA的提取。　　第二部分 CpG岛甲基化表型（CIMP）结直肠癌新的分子标记物鉴定和临床病理特征研究　　目的：　　结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，近几年其发病率快速增长，5年存活率为明显低于其它的许多肿瘤。早期诊断是增加结直肠癌存活率的关键方法。DNA甲基化是癌症发生和发展的主要原因之一，CPG岛甲基化表型（CIMP）的广泛启动子甲基化是直肠癌演进过程中的明显特征。然而，关于CIMP准确的临床和分子特征还存在争议。这种争议的可能的解释包括用于定义CIMP的不同甲基化标志以及不同高甲基化方法的应用。基于以前的在直肠癌CIMP/非-CIMP中DNA甲基化的研究，选择了启动子区域的5个在肿瘤的演进中发生甲基化的CPG岛，分别是SHISA3,STC2,TMEM200B,CTSL1and LRIF1，作为一组新的CIMP分析的基因组合标志。肿瘤病人血液中存在大量的DNA，因此，肿瘤病人血液中DNA甲基化有可能作为肿瘤的诊断标志物。探讨血液游离DNA中CpG岛表型甲基化是否可以作为结直肠癌的早期诊断和预后判断指标。　　方法：　　病例和样本的收集：216例肿瘤样本来自2010年到2013年期间在长海医院接受治疗性切除的结直肠癌（CRC）患者（28到80岁，平均年龄54.6岁；112为女性，104为男性），这些患者经确认前期没有进行全身性的治疗的情况下进行原发性肿瘤的彻底切除，并且有明确的结直肠癌（CDC）病理组织学诊断（106例结肠癌，110例直肠癌）.另外,我们收集了62例病人的血浆用于CIMP分析。　　组织标本和血液标本DNA的分离：通过基因组DNA纯化试剂盒(DP329)以及游离核酸提取试剂盒(DP339)（中国，北京，tiangen）并参照说明书提取组织和血浆标本中的DNA。肿瘤组织中DNA的浓度通过分光光度计来测定，血浆游离的DNA的量是通过使用DNA试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)参照厂商说明书来测定的。　　用ddPCR进行CPG岛甲基化表型特异标志基因的甲基化分析：组织中500ng的基因或者血浆中200ng的cfDNA(血浆游离DNA)通过使用ZymoResearchEZ公司的DNA甲基化试剂盒进行硫酸氢转化，转化后的DNA在微滴超混试剂盒(Bio-Rad公司)和Qx100TM微滴数字PCR系统下进行分析。　　结果：　　评估新的CIMP基因组合的敏感性和特异性：在这110例肿瘤病例分析中，用16个基因座分析时有34(30.9%)例标本是CIMP阳性的结果，用新的五个基因座分析时有36(34.5%)例标本是CIMP阳性的结果，高达98.2%的一致性，100%的特异性和97.4%的敏感性。而用经典的五个基因组合分析时，虽然有34(30.9%)例标本是CIMP阳性的结果，但是用16个基因座分析时只有28例标本是CIMP阳性的结果，仅仅只有89.1%的一致性，82.4%的特异性和89.5%的敏感性。这个结果明显的展示出新的基因组合比经典的基因组合有更好的敏感性和特异性。　　检测血浆DNA的CPG岛甲基化表型的敏感性和特异性：从40个健康捐献者的血浆中提取出cfDNA。五个基因标记的甲基化频率为0到0.02%，选择0.02%作为甲基化与非甲基化之间的临界值。然后比较了62个病例的肿瘤组织的gDNA和血浆的cfDNA的甲基化率。19例CIMP阳性的病例（用新的基因组合分的类）中有16（84.2%）例在血浆中也检测出了CIMP阳性。表明当肿瘤组织无法获取是，用病人的血浆进行CIMP分析也是可行的。　　结论：　　SHISA3,STC2,TMEM200B,CTSL1and LRIF1，作为一组新的CIMP分析的基因组合标志比经典的5个基因组合（CACNA1G,IGF2,NEUROG1,RUNX3,and SOCS1）在CIMP分析上有更好的敏感性和特异性。血液游离DNA中CpG岛表型甲基化可以作为结直肠癌的早期诊断和预后判断指标。