论文部分内容阅读
铅(Pb)是土壤环境中含量最多的重金属之一,其对植物生长发育的各方面均可产生毒害作用,并且可以通过食物链最终在人体富集,严重危害农林业生产及人类健康。杨树等多年生木本植物生物量大,根系发达,与食物链关联较小,更适合应用于生物修复,改良土壤环境。目前在对植物重金属耐受机制的解析中,虽然已经鉴定了许多重金属吸收和转运相关的基因,但重金属耐受性是一个复杂的数量性状,单一基因不足以解释其内在的调控机制。近年来研究者发现lncRNA能够参与到植物生长发育以及对不良环境适应中,发挥重要的调控作用。然而,lncRNAs对木本植物重金属耐受性的遗传调控作用仍知之甚少。本研究以一年生毛白杨良种1316(Poplus tomentosa cv.1316)为实验材料,进行Pb处理。通过转录组测序揭示毛白杨(Poplus tomentosa)铅胁迫响应lncRNAs的基本特征与表达模式,通过靶基因预测及关联分析挖掘胁迫响应lncRNAs发挥的生物学功能及其转录调控作用,剖析胁迫响应lncRNAs对光合及生长性状的加性、显性和上位性遗传效应,并利用分子生物学手段及遗传转化技术解析了候选lncRNA及其靶基因的功能与转录调控机制。本论文为lncRNA在木本植物重金属耐受性遗传调控研究提供理论基础,为培育具备生物修复功能的综合优良新品种提供理论指导。主要研究结果与结论如下:(1)毛白杨光合系统对高浓度铅应激处理极为敏感,铅处理6h是生理响应的关键转变时间节点。以胁迫处理6h的样品进行转录组测序,共鉴定到226个lncRNAs受Pb胁迫诱。靶基因预测及基因功能注释分析表明,这些lncRNAs可能通过对靶基因的调控进而参与次级代谢产物的生物合成、碳代谢、能量代谢和信号转导等途径。(2)通过关联分析在基因组水平上鉴定到5个DE-lncRNA基因和6个DE-PTG基因同时与2~4个表型关联,为多效性基因。其中,4个DE-lncRNA-target pairs能够同时与相同的表型性状显著关联,表明这些DE-lncRNAs可能通过对靶基因的调控而影响Pb处理下杨树的生理和表型性状。通过对显著关联位点的上位性遗传效应解析,发现PMAT-PtoMYB46与PCIT-PtoMYB43靶基因对同时对不同的表型性状具有上位性效应。由此推测这些DE-lncRNA-target pairs在铅处理下杨树的生长中具有十分重要的生物学功能。(3)在毛白杨中PtoMYB46、PtoMYB43均可以响应不同的非生物胁迫。PtoMYB46的过表达可以提高拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿素含量(Chl)、叶面积(LA)、叶片干重(LDW)、净光合速率(Pn)和转酮醇酶活性(TKT),且可以提高对Pb的吸收以及对盐、干旱、铅的抗性。在杨树中,PtoMYB46的过表达可以促进生长、提高Pb的耐受性和对Pb吸收;在拟南芥中,PtoMYB43的过表达可以提高除Chl外的LA、LDW、Pn和铁氧还蛋白含量(FDX)共4个表型值,且可以提高对Pb的吸收以及对盐、铅的抗性,但对干旱胁迫耐受性无明显影响。在杨树中,PtoMYB43的过表达促进杨树生长并可以增强对铅胁迫的耐受性,提高对铅的吸收。(4)通过DAP-seq测序分析,鉴定PtoMYB46蛋白富集最为显著的motif序列为“ACCWAMY”;PtoMYB43蛋白富集最显著的motif序列为“TYACCWAMYWH”。结合RNA-seq与DAP-seq数据分析,鉴定到PtoMYB46的123个靶基因响应铅处理,PtoMYB43的88个靶基因响应铅处理,推测PtoMYB46与PtoMYB43可能通过对这些靶基因的调控以响应铅胁迫。(5)基于生物信息学及分子生物学实验分析结果,建立了调控杨树对Pb的吸收及生长调控的模型,该分子模型包括3个调控通路:(i)PtoMYB46受Pb诱导下调表达,PtoMYB46蛋白通过降低Pto MATE启动子活性和作用于其3动子活性和抑制Pto MATE的表达,而这种抑制作用在Pb处理下随PtoMYB46的表达水平降低而减弱,导致植株对Pb吸收的降低。(ii)PtoMYB46通过对靶基因PMAT调控而影响对Pb的吸收。在这一通路中,由于胁迫处理下PtoMYB46表达降低,PtoMYB46蛋白对PMAT表达的正调控作用被削弱,进而降低了PMAT对Pto MATE的抑制作用。最终导致Pto MATE的表达水平上调,从而抑制Pb的吸收。(iii)PtoMYB46靶向调控Pto ARF2并抑制其表达,从而在Pb胁迫下正调控植物生长。