血管增生(neovascularization)与肿瘤的生长与转移、血管增生性眼病、类风湿关节炎等重大疾病密切相关。目前治疗血管增生性疾病着眼于血管增生平衡调空的两个方面：要么应用血管增生抑制剂，要么采用血管增生刺激因子的拮抗剂，以恢复病理状态下被打破的血管增生调空的平衡。近年来，人纤溶酶原(plasminogen)的水解片段kringle5因其独特的性质引起了科学界的重视。 K5是人纤溶酶原中第五个环状结构域，能特异性的抑制内皮细胞生长，是最强的血管增生抑制因子之一。本实验室在以前的研究中，利用原核表达体系获得K5和K5突变体重组蛋白，并观察它们对糖尿病性视网膜病和肿瘤的作用。研究显示K5具有分子量小，性质稳定，能有效的抑制血管内皮细胞的迁移以及增殖，对于糖尿病性视网膜血管增生和肿瘤的生长具有较强的抑制作用。 由于原核表达基因工程重组蛋白具有毒性无法去除，在体内易降解，需反复注射等无法克服的缺点，且不利于用于进行内源性：K5的作用机制的探讨。因此，本研究在原有的工作基础上，希望通过基因治疗的途径来改善上述问题。鉴于缺陷性腺病毒载体具有安全、高效、简单易行等优点，我们选择了Adeasy-1系统来作为K5基因治疗的载体。Adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架质粒，通过其穿梭质粒Adtrack-CMV将外源性基因与病毒骨架整合，从而包装出具有广泛感染性的重组腺病毒。本研究构建携带．K5基因(含和不含真核信号肽)的重组腺病毒，鉴定腺病毒感染力和目的基因表达情况，并进行基本的细胞内功能研究，为进一步研究携带K5的腺病毒体内抑制血管增生的效果和机制奠定基础。 第一部分 K5病毒骨架的构建方法： 1．根据K5的序列设计特异性引物，将其重组进入pDisplay质粒用以获取pDisplay质粒中的真核信号肽序列； 2．测序鉴定重组质粒； 3．根据K5的序列设计特异性引物，分别克隆出不带信号肽的K5与携带信号肽的spK5基因片段(真核信号肽序列来源于pDisplay质粒)，将其重组进入腺病毒穿梭质粒构建重组体； 4．测序鉴定重组质粒； 5．将穿梭质粒与Adeasy-1质粒Pme-I线性化后在大肠杆菌BJ5183中同源重组： 6．将上述同源重组质粒Pac-I线性化后获得三种病毒骨架Ad-K5、Ad-spK5与Ad-control，纯化灭菌； 7．酶切和PCR鉴定病毒骨架。 结果： 1．DNA序列分析显示穿梭质粒构建正确； 2．酶切鉴定证明同源重组成功，PCR鉴定证明病毒骨架中携带有目的基因。 第二部分重组腺病毒的包装纯化与功能实验方法： 1．脂质体包裹法将上述三种纯化灭菌的病毒骨架DNA导入293A细胞中，包装病毒； 2．观察GFP的表达情况； 3．8-10日左右冻融法裂解细胞，获取原代病毒液； 4．用原代病毒液感染293细胞，大量扩增病毒； 5．CsCl梯度离心纯化病毒液； 6．感染Hela细胞、肝细胞，内皮细胞等观察病毒感染能力； 7．Western-blot检测病毒携带的K5基因表达情况； 8．MTT法检测重组病毒对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。 结果： 1．绿色荧光蛋白(GFP)表达显示病毒包装良好； 2．纯化后病毒具有很高的感染细胞的能力； 3．western-blot结果显示携带K5基因的腺病毒可在宿主细胞中表达K5和spK5蛋白。 4．MTT结果显示含与不含信号肽的K5重组腺病毒均有抑制血管增生的作用。 结论 1．成功构建了Ad-K5、Ad-spK5以及Ad-control三个重组腺病毒骨架质粒； 2．成功包装出了rAd-K5、rAd-spK5以及rAd-control三个重组腺病毒； 3．纯化后的三种病毒对人正常肝细胞、Hela细胞、人脐静脉内皮细胞等多种细胞中都具有很高的感染力； 4．重组腺病毒在细胞中成功表达出目的蛋白，显示重组腺病毒具有表达目的蛋白的活性； 5．MTT结果显示含与不含真核信号肽的重组腺病毒均对血管内皮细胞有着生长抑制作用。因此，我们初步认为K5可以通过进入到细胞内发挥作用。对于是否存在其他作用模式，或者K5在胞内发挥作用的具体位置和作用方法，则还需要进一步的实验研究来证实。该研究为后续的基因治疗奠定了基础。