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IFN-τ是反刍动物妊娠后胚胎向母体发出的最初妊娠信号,在母体妊娠识别过程中起着重要的作用。本试验以牛体内胚胎为材料,通过一步法PCR从胚胎基因组中扩增牛IFN-τ基因(含信号肽),扩增产物与中间载体pGEM-T Vector连接,经过酶切和。DNA测序鉴定后,通过定向克隆分别将含信号肽和不含信号肽的牛IFN-τ基因与原核表达载体pET-30a(+)连接,并分别命名为pET-blFNS(+)-τ和pET-bIFNS(-)-τ,采刚IPTG进行诱导表达,采用10M尿素溶解包涵体,通过Ni<'2+>亲合层析进行纯化,通过抗病毒活性检测和对牛子宫内膜上皮细胞的影响两个方面鉴定rblFN-τ的生物活性。
实验结果表明,通过一步法 PCR扩增得到的牛IFN-τ(含信号肽)基因与已知序列(XM593584)比对后,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别达99%和97%,证明成功克隆了牛IFN-τ基因(含信号肽)。在25℃和37℃条件下,采用0.1mM IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳检测,含有信号肽的pET-bIFNS(+).-τ质粒与诱导前和空载体相比,诱导后,在约20kD处均无特异性蛋白条带产生,而不含信号肽的pET-bIFNS(-)-τ质粒诱导后与对照相比,在约20kD处均有特异性条带产生,证明不含信号肽的牛IFN-τ基因可以在大肠杆菌中进行表达,并且表达量高。牛IFN-τ在诱导表达过程中,形成了不溶性的包涵体,经过10M尿素溶解后,部分rbIFN-τ从沉淀中转移至上清中,在活性条件下,纯化得到了纯度在90%以上的rbIFN-τ。rbIFN-τ的抗病毒活性为1×10<'4>U/mg,在牛子宫内膜上皮细胞培养过程中添加rbIFN-τ,可以改变上皮细胞的形态,并且细胞体积明显增大。
研究表明在不提取胚胎基因组DNA的情况下,采用一步法PCR可以扩增得到牛.IFN-τ基因;在37℃,0.1mM IPTG诱导条件下,可以利用pET-30a(+)载体在大肠杆菌中表达IFN-τ,得到的rblFN-τ具有一定生物活性.