重组酶介导扩增（RAA）技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术,具有我国自主知识产权,因其具有快速、灵敏、特异、高效、仪器设备要求低、测试成本低、操作简单的特点,非常适合于偏远地区和现场的快速筛查。RAA技术从发明至今,已经应用于多种病原微生物的检测,主要检测病原体的特异性序列,但是缺乏内部扩增质控。探针介导的重组酶扩增（PDRA）是基于RAA技术的改良,利用单探针和单引物进行SNP位点识别,利用该方法检测了 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）A1298C的SNP位点,证明该技术具有检测SNP位点和点突变的潜力。规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白13a（Cas13a）系统,是一种新的RNA靶向系统,Cas13a具有RNase活性,当crRNA与Cas13a蛋白形成复合物,然后识别靶标RNA,特异性切割靶标RNA,同时激活Cas13a的非特异性切割活性,CRISPR-Cas13a系统被开发为一种核酸检测工具,尤其与RPA技术结合后,可以检测单拷贝核酸以及单碱基突变。手足口病是由肠道病毒感染引起的儿童急性传染病,已经成为我国的一个重要的公共卫生问题,肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CVA16）是引起手足口病的两种主要病原体,因此建立病原体的快速检测方法,对疾病的早发现、早诊断和早治疗以及对疫情防控具有重要意义。结核病特别是耐药结核病给我国造成了极大的疾病负担,而利福平在结核治疗中非常重要,如果结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）发生利福平耐药,会增加治疗难度和治疗费用,增加结核传播风险。有许多关于结核分枝杆菌利福平耐药的机制研究,最主要的是利福平作用靶标基因rpoB基因发生突变,从而造成细菌耐药。因此,需要建立一种快速检测rpoB基因突变的方法。本文基于RAA技术,PDRA技术,CRISPR-Cas13a技术,建立检测EV71和CVA16的RT-RAA方法并进行评价,建立检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变的PDRA方法、RAA-Cas13a方法并进行评价。第一部分逆转录重组酶介导扩增方法应用于肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测目的:本研究基于RAA技术分别建立肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CVA16）的两种灵敏、特异的快速检测方法。第一种是基于恒温荧光检测系统的含内参的双重实时荧光RT-RAA方法（real time RT-RAA）,第二种是结合侧流层析试纸条的RT-RAA 方法（LFSRT-RAA）。方法:（1）从GenBank数据库下载EV71和CVA16的基因序列,序列比对后选择VPI基因的保守区作为RAA引物和探针的设计区域,根据设计原则设计数对引物对,通过实时荧光法筛选最佳引物对,建立实时荧光RAA方法。（2）加入内参探针和内参质粒,建立含内参的双重实时荧光RT-RAA方法。（3）进行逆转录酶、反应温度的优化从而确定最佳反应条件。（4）依据实时荧光法筛选的最佳引物和探针序列,按照试纸条法要求进行修饰,建立侧流层析试纸条RT-RAA方法。（5）采用含EV71、CVA16的VP1保守基因的重组质粒标准品分析两种方法的灵敏性,采用其他肠道病毒分析特异性。（6）采用已建立的双重实时荧光RT-RAA方法、侧流层析试纸条RT-RAA方法和文献报道的实时荧光RT-qPCR方法检测445份手足口病疑似病例的临床标本,对方法的检测效能进行评价。结果:建立了 EV71和CVA16的含内参的双重实时荧光RT-RAA方法,在荧光检测仪中42℃反应30分钟。检测EV71和CVA16的检测限为47拷贝/反应和38拷贝/反应,特异性好,与其他肠道病毒无交叉反应。检测445份临床标本,与RT-qPCR相比,双重实时荧光RT-RAA检测EV71和CVA16的诊断灵敏度分别为92.3%和99.0%,诊断特异性分别为99.7%和100%。建立了可视化的EV71和CVA16的侧流层析试纸条RT-RAA方法,42℃反应30分钟,采用侧流层析试纸条对产物进行检测,检测EV71和CVA16的检测限均为91拷贝/反应,特异性好,与其他肠道病毒无交叉反应。检测445份临床标本,与RT-qPCR相比,侧流层析试纸条RT-RAA检测EV71和CVA16的诊断灵敏度分别为90.1%和94.9%,诊断特异性分别为99.7%和100%。结论:建立的EV71和CVA16双重实时荧光RT-RAA方法和侧流层析试纸条RT-RAA方法具有在偏远地区或者现场应用的潜力。第二部分探针介导的重组酶扩增应用于结核分枝杆菌rpoB基因突变检测目的:本研究基于探针介导的重组酶扩增（PDRA）建立快速检测结核分枝杆菌（MTB）rpoB基因突变的检测方法。方法:（1）针对rpoB基因的3个常见突变位点（516、526、531）分别设计野生型和突变型的exo探针,以及共同的反向引物,然后分别构建检测体系,在39℃条件下恒温扩增40min。（2）采用野生型和突变型的重组质粒进行方法的特异性和灵敏度评估。通过某一种检测体系检测不同类型的重组质粒,确定该体系的特异性;通过某一种检测体系检测系列稀释的对应重组质粒,确定该体系的灵敏度。（3）应用建立的PDRA方法检测6株MTB利福平耐药菌株,35份MTB培养阳性的痰标本,并与一代测序结果进行比较。结果:（1）初步建立了 516位点的PDRA方法,该方法包含4种检测体系（TB-516-W、TB-516-GGC、TB-516-GTC和TB-516-TAC）,4种检测体系平行检测标本,根据阳性阈值时间早晚判断该位点的碱基类型。4种检测体系的特异性良好,探针与靶序列完全匹配时,阳性阈值时间早;探针与靶序列不完全匹配时,阳性阈值时间晚,具有稳定的阳性阈值时间差值。该方法检测对应重组质粒的灵敏度为103拷贝/μ1。检测6株MTB耐药菌株、35份MTB培养阳性痰标本的PDRA结果与测序结果一致。（2）虽然针对526位点和531位点设计了特异性exo探针,但无法区分野生型和突变型。结论:本研究初步建立了可应用于MTB rpoB基因516突变点检测的PDRA方法,具有一定的实验室应用价值。第三部分RAA结合CRISPR-Cas13a应用于结核分枝杆菌rpoB基因突变检测目的:将重组酶介导的扩增（RAA）技术与规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a（CRISPR-Cas13a）系统相结合,建立一种快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变点的方法（RAA-Cas13a）。方法:（1）针对rpoB基因设计用于扩增的RAA引物,同时在其中一条引物的5’端增加T7启动子序列,用于后续的体外转录RNA。（2）针对516位点、526位点、531位点分别设计特异性的野生型和突变型crRNA,构建CRISPR-Cas13a检测体系。（3）采用野生型和突变型的重组质粒评估其特异性和灵敏度。（4）选择结核分枝杆菌利福平耐药菌株、临床标本对方法进行评估,并与一代测序结果比较。结果:确定了 516位点、526位点和531位点特异性的crRNA,两步和一步RAA-Casl3a方法检测重组质粒的灵敏度为106拷贝/μl、107拷贝/μl,采用菌株初步评估了 516位点和531位点的检测方法,结果与测序结果一致。结论:RAA-Cas13a方法可以识别MTB rpoB基因突变,但还需进行方法优化。