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目的:基于古文献研究,探讨肾虚血瘀、肾脑失济与缺血性中风的关联性及眼针治疗优势;通过检测神经功能缺损评分、旷场试验、苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin,HE)、Nissl染色、5-溴-2’-脱氧尿苷(Uridine,5-bromo-2’-deoxy,Brd U)标记神经元等指标,观察眼针干预对脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠神经保护作用;通过检测脑组织中A2B5、O4、CNPase、MBP、Olig2、MAG等蛋白的表达水平,阐述眼针干预对少突胶质细胞成熟及活化的影响;通过检测脑组织中Wnt、Dvl、GSK-3β、β-catenin蛋白表达,探讨眼针通过调控Wnt信号通路发挥促进少突胶质细胞成熟并活化,加速髓鞘再生的作用机制,从而进一步探讨眼针通过补肾活血疗法发挥“肾脑相济”作用,为中医眼针特色疗法的临床应用提供新思路。材料与方法:1.阅读辽宁中医药大学中医神志病数据库,对相关古籍条文进行分析,总结古代医家对眼针、五轮八廓学说、中风的认识,探讨眼针疗法以“五轮八廓”学说为理论基础融合“肾脑相济”理论治疗肾虚血瘀型中风的可行性。2.本研究选取60只成年SPF级SD大鼠,雄雌各半作为研究对象,将60只大鼠按体重标记为1-60号,然后将大鼠随机(随机数字法)分为两组,即假手术组(12只);模型组(48只)。对模型组48只大鼠采用线栓法复制CI/RI模型,采用神经功能学评分联合TTC(Triphenyl tetrazolium chloride)染色及HE染色对模型鼠进行评价,将模型评价成功的大鼠随机(随机数字法)分为3组,即模型对照组;抑制剂组;眼针组。干预措施:眼针组大鼠于脑缺血再灌注2h、再灌注12h、再灌注24小时分别进行眼针治疗,针刺取穴:肾区、上焦区、肝区和下焦区;抑制剂组取材前24小时,给予Wnt-C59口服给药,假手术组、模型对照组正常饲养,通过行为学检测(神经行为学评分、旷场实验)、形态学检测(HE染色、Nissl染色、Brd U标记)、少突胶质细胞活化相关蛋白(A2B5、O4、CNPase、MBP、Olig2、MAG)检测及Wnt信号通路关键因子(Wnt、Dvl、GSK-3β、β-catenin)蛋白进行检测,旨在观察眼针对CI/RI大鼠少突胶质细胞的影响,从少突胶质细胞参与髓鞘再生作用探讨针疗法对CI/RI大鼠脑保护作用机制。结果:1.文献分析:通过对古文献梳理,认为肾虚血瘀、肾脑失济为缺血性中风的主要病机,彭氏眼针对本病的治疗方面发挥其优势与作用。2.改良线栓法成功复刻CI/RI大鼠模型:神经功能学评分结果显示,与假手术相比,模型组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.01)。脑组织TTC染色结果显示,假手术组大鼠脑组织未见明显异常,模型组大鼠右侧脑组织局部可见白色缺血缺氧区。脑组织HE染色结果显示,假手术组大鼠右侧海马中神经细胞结构完整,而模型组大鼠右侧脑组织出现不同程度的破坏。3.眼针疗法改善CI/RI模型大鼠认知功能障碍:神经功能评分结果显示,与假手术组比较,脑缺血再灌注后2h,模型对照组、抑制剂组及眼针组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.01);经过眼针治疗后,眼针组大鼠神经功能评分明显降低(P<0.01)。旷场实验结果显示,眼针干预前,与假手术组比较,模型对照组、抑制剂组及眼针组大鼠中间格停留时间及运动距离均显著减小(P<0.01)。眼针干预后,与假手术组比较,模型对照组、抑制剂组及眼针组大鼠中间格停留时间及运动距离均显著减小(P<0.01),差异有统计学意义;与模型对照组比较,眼针组大鼠中间格停留时间及运动距离均显著增加(P<0.01),差异有统计学意义。脑组织HE染色结果显示,经眼针治疗后,与对照组相比,抑制剂组大鼠脑组织损伤程度明显提高,眼针组大鼠的脑组织含水量减少、各种病理改变均有不同程度的好转。4.眼针疗法促进CI/RI模型大鼠神经元再生:Nissl染色检测结果显示,假手术组大鼠脑组织中神经元结构完整,阳性细胞较多,神经元尼氏小体清晰,排列整齐;与假手术组比较,模型对照组大鼠脑组织中神经元排列稀疏,部分尼氏小体模糊;眼针组大鼠脑组织中神经细胞病变较模型对照组明显减轻,神经细胞数目增多,有统计学意义(P<0.01),尼氏小体染色较清晰,形态接近正常。Brd U标记检测结果显示,与假手术组比较,模型对照组、抑制剂组、眼针组大鼠脑组织中Brd U阳性细胞数显著减少(P<0.01);与模型对照组比较,抑制剂组大鼠脑组织中Brd U阳性细胞数显著减少(P<0.01),眼针组Brd U阳性细胞数显著增多(P<0.01)。5.眼针疗法活化少突胶质细胞相关蛋白表达:免疫荧光检测A2B5、O4、CNPase结果显示,与假手术组比较,模型对照组、抑制剂组、眼针组大鼠脑组织中少突胶质细胞活化相关蛋白A2B5、O4、CNPase表达水平显著下调(P<0.01);与模型对照组比较,抑制剂组大鼠脑组织中少突胶质细胞活化相关蛋白A2B5、O4、CNPase表达水平显著下调(P<0.01),眼针组A2B5、O4、CNPase表达水平显著上调(P<0.01)。MBP、Olig2、MAG检测结果显示,与假手术组比较,模型对照组、抑制剂组、眼针组大鼠脑组织中少突胶质细胞活化相关蛋白MBP、Olig2、MAG表达水平显著下调(P<0.01);与模型对照组比较,抑制剂组大鼠脑组织中少突胶质细胞活化相关蛋白MBP、Olig2、MAG表达水平显著下调(P<0.01),眼针组MBP、Olig2、MAG表达水平显著上调(P<0.01)。6.眼针激活Wnt信号通路促进CI/RI大鼠神经元再生:免疫组化及免疫印迹法检测Wnt通路关键蛋白结果显示,与假手术组比较,模型对照组、眼针组和抑制剂组大鼠脑组织中Wnt、Dvl、β-catenin蛋白表达水平显著下降(P<0.01),GSK-3β蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,眼针组大鼠脑组织中Wnt、Dvl、β-catenin蛋白表达水平显著升高(P<0.01),GSK-3β蛋白表达水平显著下降(P<0.01),抑制剂组大鼠脑组织中Wnt、Dvl、β-catenin蛋白表达水平显著下降(P<0.01),GSK-3β蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结论:1本研究对古文献梳理,发掘肾虚血瘀、肾脑失济为缺血性中风的主要病机,彭氏眼针对本病的治疗方面发挥其优势。2通过观察眼针干预CI/RI大鼠的效应,证实眼针疗法能够促进CI/RI后脑组织的修复,恢复神经功能,改善缺血性中风后认知功能障碍。3眼针通过促进CI/RI大鼠尼氏小体和少突胶质细胞及其相关蛋白表达,加速髓鞘形成,促进神经元再生。4眼针通过活化Wnt信号通路,促进少突胶质细胞成熟及活化,促进神经髓鞘再生,从而发挥神经保护作用。