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目的非小细胞肺癌(NSCLC)是一种常见的恶性肿瘤,是全球因癌死亡的重要原因。尽管对NSCLC的治疗已取得一定进展,但效果仍不尽如人意,5年总生存率不足20%。不同抗癌药物的联合治疗对克服化疗耐药性,提高患者生存具有重要意义。牛蒡子苷元主要来源于传统中药牛蒡子,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等活性。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(1AP)的一个重要成员,调控细胞生存和增殖。大量研究表明,Survivin基因高表达是肿瘤细胞耐药性的-一个重要机制。本研究旨在探讨牛蒡子苷元对NSCLC顺铂敏感性的增强作用和Survivin基因在牛蒡子苷元促进肺癌细胞敏感性中的作用。方法1.对人肺癌细胞H460进行细胞培养后,分别应用不同浓度的牛蒡子苷元单独或联合顺铂进行药物处理。2.在细胞增殖实验中,人肺癌细胞H460分别应用1-20μM不同浓度的牛蒡子苷元处理72小时,然后收集细胞检测细胞活性。在细胞凋亡和细胞周期实验中,H460细胞应用10μM牛蒡子苷元处理48小时,然后收集细胞,分析细胞凋亡和细胞周期分布变化。在牛蒡子苷元联合顺铂处理时,H460细胞与10μM牛蒡子苷元和2或10μM顺铂共同孵育48小时,然后收集细胞分析细胞活性、细胞凋亡或细胞周期。3.应用MTT法测定牛蒡子苷元单独或联合顺铂对H460细胞的影响。应用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。应用碘化丙锭(PI)染色法结合流式细胞术检测细胞周期分布情况。应用蛋白免疫印迹法检测切割型Caspase-3和切割型PARP的表达水平。4.应用RT-PCR技术从H460细胞中扩增全长人Survivin cDN A,并将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建人Survivin基因真核表达质粒。将pcDNA3.1-Survivin重组质粒或空载体分别转染H460细胞,孵育24 h后,应用Western blot法检测Survivin过表达情况；转染细胞与牛蒡子苷元单独或联合顺铂处理,应用Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡情况。5.应用SPSS11.5软件对实验数据进行统计分析,计量数据以均数±标准差表示,每个实验重复做3次,各组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用Tukey post hoc检验,检验水准为α=0.05。结果1.与对照细胞相比较,牛蒡子苷元处理可显著抑制H460细胞增殖,并且这种抑制作用具有剂量依赖性(P<0.05)。当应用牛蒡子苷元10μM处理H460细胞时,H460细胞增殖活性被抑制约50%。顺铂的浓度为2和10μM时分别可抑制H460细胞增殖28%和65%。牛蒡子苷元在10μM时可显著增强顺铂介导的抑制H460细胞增殖(P<0.05)。2.牛蒡子苷元处理后显著诱导H460细胞凋亡发生,凋亡率为9.5±2.0%,显著高于对照组的2.7±1.2%(P<0.05)。较对照细胞,牛蒡子苷元处理H460细胞具有更好水平的切割型caspase-3和PARP(P<0.05)。2和10μM顺铂处理H460细胞48小时后分别诱导8.4±1.9%和15.6±2.3%细胞发生凋亡。当2μM顺铂和10μM牛蒡子苷元联合后,H460细胞发生凋亡的比率增加为27.2±3.1%,这表明牛蒡子苷元可增强顺铂对H460细胞凋亡的诱导作用(P<0.05)。3.2μM顺铂处理H460细胞后并不能改变细胞周期分布。而10μM牛蒡子苷元处理后可导致H460细胞G1期细胞数显著增加而S期和G2/M期细胞数显著下降(P<0.05)。当顺铂与牛蒡子苷元联合处理时,H460细胞G1期细胞同样显著增加,S期和G2/M期显著降低(P<0.05)。4.与未转染和转染空载体质粒的H460细胞相比,转染pcDNA3.1-Survivin重组质粒H460细胞Survivin水平显著增加,提高大约10倍(P<0.05)。低剂量顺铂对H460细胞Survivin蛋白表达影响不显著,而牛蒡子昔元可显著抑制Survivin蛋白表达水平(P<0.05)。当牛蒡子苷元与顺铂联合作用时,Survivin蛋白表达抑制程度更大(P<0.05)。与转染空载体质粒相比,转染Survivin表达重组质粒的细胞对牛蒡子苷元单独或联合顺铂诱导的凋亡具有抗性,细胞凋亡比率显著下降(P<0.05)。结论1.牛蒡子苷元抑制H460肺癌细胞生长。2.牛蒡子苷元抑制H460肺癌细胞生长活性与诱导细胞凋亡和G0/G1期细胞周期停滞有关。3.牛蒡子苷元增强顺铂对H460细胞凋亡的诱导作用。因而,牛蒡子苷元可能在基于铂制剂抗NSCLC治疗中有临床应用价值。4.牛蒡子苷元抑制H460肺癌细胞中Survivin基因表达,牛蒡子苷元促H460肺癌细胞顺铂敏感性与抑制Survivin通路有关。