活性氧（Reactive oxygen species,ROS）是体内的一类重要物质,它是一些含氧物质的总称,包括超氧阴离子（·O₂^-）,过氧化氢（H₂O₂）,羟基自由基（·OH）和单线态氧（¹O₂）,具有较高的反应活性。ROS在细胞中起着双刃剑的作用,正常水平的ROS可促进细胞增殖和维持体内稳态,当到达某一阈值后,ROS可对细胞成分如DNA、蛋白质等造成氧化损伤,从而引起细胞毒性,导致细胞凋亡和坏死。因此,利用这一特性,外源性ROS作为治疗剂已广泛应用于抗肿瘤研究中,其中,¹O₂和·OH是两种效能最高的ROS,基于这两种ROS的抗肿瘤手段得到了广泛关注,如¹O₂可通过光动力治疗（Photodynamic therapy,PDT）或声动力治疗（Sonodynamic therapy,SDT）方法产生,·OH可通过化学动力学疗法（Chemodynamic therapy,CDT）产生。CDT是一种不依靠外部能量（如光、声、热等）,利用芬顿反应（Fenton reaction）或类芬顿反应（Fenton-like reaction）产生·OH,从而引发细胞死亡的手段,反应物中涉及二价铁离子和H₂O₂。CDT的优点在于无需借助外部能量。然而,通过芬顿或类芬顿反应产生·OH的效率高度依赖于周围环境的p H值,当p H为3-5时这一反应具有较高的·OH产率。然而细胞质和细胞外液中的p H均偏中性,因此严重限制了CDT的抗肿瘤功效。因此,开发具有非p H依赖的ROS抗肿瘤疗法具有重要意义。作为另一种具有高毒性的ROS,¹O₂也得到了广泛关注。相比于利用CDT产生·OH的方法,¹O₂的产生不受低p H的限制。然而,传统的PDT和SDT方法需要依靠光敏剂或声敏剂,通过光照射或超声处理来产生¹O₂。PDT受到光的组织穿透能力有限的限制,治疗效果受到严重影响。相较于PDT,SDT使用超声可达到深层的组织,但其¹O₂的量子产率通常低于PDT。此外,由于给药时光敏剂和声敏剂的非特异性分布,两者均会对正常组织造成不可忽视的毒性。同时,实体肿瘤部位的缺氧环境也会大大限制两种氧气依赖型治疗手段的治疗效果。能量依赖的PDT/SDT患者顺从性较低。在生物学环境中,¹O₂还可通过多种无需提供能量的方法产生。其中,次氯酸根离子（ClO^-）可与H₂O₂通过化学计量反应生成¹O₂。该反应无需借助外部能量,有望实现肿瘤的选择性治疗,减少对正常组织的毒副作用。ClO^-的生成可借助于髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）或者氯过氧化物酶（Chloroperoxidase,CPO）的催化作用。因此,通过纳米载体递送两种酶至肿瘤部位,进而产生ClO^-,与肿瘤部位较高浓度的H₂O₂反应产生¹O₂,起到杀死肿瘤细胞的作用。但是,MPO在体内的化学稳定性较差,而CPO属于外源性酶,其安全性和免疫原性仍不明确。此外,肿瘤细胞的H₂O₂浓度虽较正常细胞内高,但仍在微摩尔范围,这在一定程度上限制了¹O₂的产率。如果可以通过载体直接递送ClO^-,并同步增加肿瘤组织内的H₂O₂浓度,可以提高¹O₂的有效浓度,进而可避免MPO和CPO以及低浓度H₂O₂对¹O₂产率的限制问题。ClO^-的高效递送极具挑战。金属有机骨架（Metal organic frameworks,MOF）作为纳米多孔材料,具有比表面积大、载药量高、表面可修饰、负载物可控释放、可包载不同类型药物的优点。沸石咪唑骨架材料（Zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8）作为其中的一类重要分支,已广泛用于肿瘤靶向的纳米药物递送系统中。其制备方法简单,可通过调整配方和操作参数来控制其尺寸等性能。同时,ZIF-8在生理环境中可稳定存在,在肿瘤组织的酸性微环境及细胞内溶酶体中分解,因此可用来构建p H响应型药物递送系统。基于此,本课题将ClO^-包载到由泊洛沙姆188（Poloxamer 188,F68）涂覆的纳米级金属有机骨架ZIF-8中。同时为了进一步增大肿瘤部位的H₂O₂浓度,使用药理学浓度的抗坏血酸（Ascorbate,Asc）,该浓度下的Asc已被证明可特异性地在实体瘤的细胞外液中富集并生成H₂O₂,随后H₂O₂扩散进入肿瘤细胞。通过组合递送包载ClO^-的纳米载体和Asc,有望选择性地在肿瘤组织中产生¹O₂,从而实现基于¹O₂的选择性抗肿瘤化学动力学疗法。首先,利用“一锅法”将ClO^-物理包载到MOF的内部空腔中,然后在MOF的外层涂层两亲性高分子F68以增加载体的稳定性和水相分散特性。借助¹O₂特异性荧光探针SOSG（Singlet oxygen sensor green,SOSG）,通过间接法（与H₂O₂反应）测得ClO^-的载药量为6.1±0.3%（w/w）,并且利用p H 7.4的缓冲溶液模拟生理环境,证明了ClO^-不会从载体中泄露,可安全地用于后续的细胞与体内实验。经纳米粒度及Zeta电位分析仪（Dynamic light scattering,DLS）测定,空白MOF、F68涂层MOF（MOF/F68）和载ClO^-的涂层MOF（ClO@MOF/F68）的水力学粒径分别为75.4±4.8 nm,140.1±6.3 nm和177.9±13.2 nm。载药及F68吸附均会增加粒子的水力学粒径。透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）分析证实所有样品均呈现较均匀的球形状态。此外,借助于单线态氧荧光探针SOSG验证了ClO@MOF/F68纳米载体在加入H₂O₂时可产生¹O₂,具有¹O₂敏感特性。在¹O₂生成时,纳米载体的粒径明显增加,同时衍生计数率（Derived count rate,DCR）减小。这是由于¹O₂可氧化配体2-甲基咪唑,同时生成多种含醛基、氨基的氧化产物,进一步诱导了MOF解体,粒径增加。含醛基产物的检测也进一步验证了氧化产物的生成,侧面证实了载体的¹O₂敏感特性。其次,本课题在细胞水平上验证了¹O₂的生成、细胞凋亡的诱发以及对肿瘤细胞的毒性作用。同样借助SOSG荧光探针,与MOF/F68和游离Asc两组对照相比,ClO@MOF/F68与Asc组合递送时可检测出强烈的荧光,证明ClO^-与Asc产生的H₂O₂反应生成了大量的¹O₂。此外,单独递送ClO@MOF/F68时也产生了较强的荧光,这是由于包载在纳米载体中的ClO^-与细胞中的内源性H₂O₂反应产生¹O₂的结果。此外,利用噻唑蓝比色法（Colorimetric3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT assay）分别对空白载体MOF/F68、游离Asc、ClO@MOF/F68以及ClO@MOF/F68+Asc进行细胞毒性实验。结果表明,MOF/F68的浓度在高达240μg/m L时,细胞仍具有较高的存活率,因此空白载体的细胞毒性可忽略不计。游离Asc在浓度小于1 m M时对肿瘤细胞无明显细胞毒性,因此为了消除Asc对细胞的毒性影响,本课题细胞实验中Asc的浓度均选用1 m M。ClO@MOF/F68和ClO@MOF/F68+Asc（1m M）两组的半抑制浓度(The half maximal inhibitory concentration,IC₅₀)分别为13.7±0.3μg/m L和7.0±0.2μg/m L,证明组合递送ClO@MOF/F68和Asc可显著增加细胞毒性,这源于外源性供应Asc增加了H₂O₂进而¹O₂的产量,与细胞内¹O₂的检测结果相符。活死细胞染色实验同样直观地证明了ClO@MOF/F68与Asc的协同作用。作为细胞内的主要抗氧化剂之一,谷胱甘肽（Glutathione,GSH）可抵抗¹O₂的氧化作用,并且可作为评估基于ROS抗肿瘤治疗效果的标记物。ClO@MOF/F68+Asc（1 m M）导致GSH显著降低。细胞凋亡是ROS诱发细胞毒性的主要机制,采用流式细胞仪进一步检测上述四组样品的细胞凋亡程度。空白载体MOF@F68和游离Asc（1 m M）均未诱导细胞凋亡。单独以ClO@MOF/F68处理时,细胞呈现明显凋亡,而ClO@MOF/F68+Asc（1 m M）可导致细胞凋亡程度倍增,这主要归功于¹O₂水平的提高。为了探究纳米载体的生物分布并证明纳米载体的肿瘤被动靶向能力,使用荧光探针Cyanine5（Cy5）标记纳米载体（即Cy5@MOF/F68）,并用游离Cy5作对照。由于纳米载体具有实体瘤的高通透性和滞留效应（Enhanced permeability and retention effect,EPR effect）,在小鼠静脉给药8小时后,Cy5@MOF/F68在肿瘤部位的荧光强度达到峰值,证明Cy5@MOF/F68在肿瘤部位的积累量达到最大,因此可确定后续组合给药时Asc的给药时间。与纳米载体相比,游离Cy5缺乏EPR效应导致肿瘤积累较低。给药24小时后,肿瘤和主要的健康组织的离体荧光成像分析证明了纳米载体能将药物准确高效地递送至肿瘤部位,从而有望减少对正常组织的伤害。随后的小鼠体内抗肿瘤实验采用皮下接种4T1细胞构建荷瘤动物模型。实验样品包括五组:1.磷酸盐缓冲溶液（Phosphate bufferred saline,PBS）;2.空白载体MOF/F68;3.游离Asc;4.ClO@MOF/F68;5.ClO@MOF/F68+Asc。治疗周期内每两天记录肿瘤体积,所得肿瘤抑制能力如下:ClO@MOF/F68+Asc>ClO@MOF/F68>Asc>MOF/F68>PBS。ClO@MOF/F68和Asc协作产生了良好的抗肿瘤疗效,其效果显著优于单独递送ClO@MOF/F68（p<0.01）和游离Asc（p<0.001）。这与体外细胞毒性实验结果一致。ClO@MOF/F68+Asc的体内协同作用归因于纳米载体的EPR效应加大了ClO^-在肿瘤部位的积累,同时Asc引起的H₂O₂在肿瘤部位富集,二者反应增加了¹O₂的产率,进而增强了抗肿瘤作用。游离Asc的效力低于ClO@MOF/F68,这是由于前者后者通过ClO^-递送增加了胞内¹O₂含量。空白载体MOF/F68和PBS几乎对肿瘤生长没有抑制作用。为了进一步研究肿瘤部位细胞凋亡程度,苏木精—伊红染色法（Hematoxylin and eosin staining,H&E染色）和脱氧核苷酸末端转移酶介导的d UTP缺口末端标记技术（Terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling assay,TUNEL染色）结果表明ClO@MOF/F68+Asc处理的肿瘤组织中凋亡程度最高,证实了其良好的抗肿瘤效果。此外,通过小鼠体重的监测及主要健康组织的组织学染色分析,证明所有实验组别对小鼠无严重的全身毒性。综上所述,本课题提出利用ClO^-和H₂O₂反应生成¹O₂的方式用于抗肿瘤治疗,其中ClO^-包载于F68涂层的MOF载体中,H₂O₂的肿瘤富集通过腹腔递送高浓度Asc来实现。该策略可有效避免能量依赖型递送¹O₂的弊端,例如光穿透组织能力有限,氧气依赖,光敏剂及声敏剂的暗毒性等,并将CDT的概念扩展到了芬顿反应之外,开辟了基于¹O₂的化学动力学疗法用于选择性抗肿瘤治疗的新途径。