甜菜标记位点BvRE049相关基因的电子克隆与编码区结构分析

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甜菜(Beta vulgaris L.)是我国重要的糖料作物,甜菜基因资源是开展一切分子机制研究活动的基础,也是借助生物技术改良甜菜性状等各种应用研究的前提条件。我国甜菜基因资源目前还相当缺乏,基因克隆工作处于起步阶段。现阶段而言,获得充足的基因资源仍然是甜菜生物技术研究的一项重点任务。本论文以课题组前期获得的一个与甜菜二年生性状相关的SSR分子标记位点Bv RE049为起始材料,通过电子克隆获得标记位点及其相关基因。首先利用自建的转录本数据库结合公共数据库对标记位点进行电子延伸;然后通过生物学实验,验证并克隆所得片段,获得目的片段的确切序列;重复以上过程直至获得标记位点所在区域的完整基因位点;最后对该基因位点的结构、序列特征和编码产物特征进行分析与预测。通过本研究,将加深对甜菜标记位点Bv RE049及其相关性状的认识,为甜菜生物技术研究提供新的基因资源与注释信息,为此后对该标记、基因、性状的深入研究打下基础。主要研究结果如下:(1)通过对标记位点的电子延伸,得到了一条3000bp左右的序列,位于甜菜基因组2号染色体上,有可能位于基因编码区。(2)对电子延伸结果通过生物学实验进行了克隆和验证。通过PCR扩增、回收,连接,转化,测序等,最终获得了基因位点的序列全长,总长度为3005bp。该基因在序列上与菠菜和藜麦中的PCNA-like基因的相似性较高,将基因命名为Bv PCNA-like,(3)对所得基因位点进行了生物信息学分析。在核苷酸水平上,确定了基因位点位于2号染色体,并预测出了其中包含一个长1218个碱基的ORF,编码405个氨基酸;在氨基酸水平上,推断出该基因编码蛋白没有明显的跨膜区,不属于膜结合蛋白,可能是亲水性蛋白,位于细胞核的几率相对较大,功能与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相关。(4)对基因位点的结构进行了分析,预测了基因结构,推断该基因位点可能由4段外显子组成,针对该结构设计了基因剪接位点的验证方案以及相应的引物。并且分析了基因上游的调控元件情况,预测出多种顺式作用元件。
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