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肺脏是缺血-再灌注损伤的主要靶器官之一。肺缺血再灌注损伤常发生于肺移植及体外循环等术后。炎性反应是肺缺血再灌注损伤的重要病理特征。炎性介质如活性氧基团、TNF-α和IL一1β的大量表达和释放是诱导肺实质细胞凋亡、引起肺功能下降的重要因素。细胞凋亡是一种程序性的,受多种因素(如各类细胞因子)调控的细胞死亡形式。目前大量的实验结果证明细胞凋亡在肺缺血再灌注损伤过程中发挥着重要的作用。转化生长因子β1(TGF-p1)是一种多功能的细胞因子,其作用存在多样性。在动物实验证实TGF-β1能减轻或预防缺血再灌注损伤。而TGF-β的信号传递依靠膜受体以及其下级信号分子Smads。Smad3属于Smads家族中的一员,是将转化生长因子β1(TGF-β1)与受体作用的信号由胞浆传导到胞核的中介分子。TGF-βI型受体诱导Smad3磷酸化,磷酸化后的Smad3即pSmad3在细胞内空间位置会发生改变,并转移到细胞内传递TGF-β1信号,调控目的基因的转录与表达。因此我们推测Smad3磷酸化在肺缺血再灌注损伤中可能也扮演着重要角色。本实验在建立稳定的肺缺血再灌注损伤的大鼠模型的基础上,重点评价Smad3磷酸化的作用。以TGF-β1以及Smad3磷酸化的抑制剂LY-364947为干预因素,用ELISA法测定肺组织磷酸化的Smad3即pSmad3浓度的变化,检测肺组织缺血再灌注损伤后氧自由基水平和炎性介质表达和释放的变化,并用TUNEL染色检测肺实质细胞凋亡,以探讨Smad3蛋白磷酸化在肺缺血再灌注中对肺组织细胞凋亡的调控机制。本研究分为两个部分:一、Smad3磷酸化在肺缺血再灌注损伤中对炎性介质的影响研究目的:炎性反应是肺缺血再灌注损伤的重要特征。活性氧基团,肿瘤坏死因子-α以及白细胞介素-1β介导细胞凋亡,是肺缺血再灌注损伤的重要致伤因子。我们假设Smad3磷酸化可以抑制活性氧基团,TNF-α以及IL劫难逃-1β的表达和释放并进行验证。研究方法:按Sekido’S的方法建立稳定的原位单侧肺缺血再灌注的大鼠模型。40只SD大鼠随机分为4组:假手术组(SO组,n=10),缺血再灌注组(IR组,n=10),TGFβ1组(T组,n=10),阻断剂LY-364947组(L组,n=10)。各组在在缺血再灌注10mins前均经颈静脉注射肝素100U/kg抗凝,T组同时注射TGF-β1(10ug/kg),L组同时注射TGF-β1(10ug/kg)和LY-364947(1mg/kg)。左侧肺缺血60mins后再灌注120mins,其中SO组不阻断肺门。麻醉期间用动物呼吸机支持呼吸,频率70～80次/分,潮气量1.5～2ml。再灌注结束后获取肺标本。用ELISA法测定组织匀浆的pSmard3浓度,并检测SOD活力,TNF-α以及IL-1β的浓度。研究结果:肺缺血再灌注损伤时Smad3磷酸化激活(48.482±19.602),同时有大量的活性氧基团产生,SOD活力明显下降(15.499±3.487)。同时TNF-α和IL-1β大量表达(2.492±0.690,2.557±0.542)。TGF-β1增强Smad3磷酸化的激活(63.607±17.194),随着pSmad3的增加,SOD消耗下降(22.441±3.909),TNF-α和IL-1β表达被抑制(1.438±0.392,1.452±0.498)。LY-364947抑制Smad3磷酸化(13.763±8.732),TNF-α和IL-1β表达增加(1.921±0.417,2.029±0.599),SOD消耗增加,活力下降(18.892±3.176)。研究结论:活性氧基团、TNF-α以及IL-1β诱导细胞凋亡,是肺缺血再灌注损伤的重要致伤因子。Smad3磷酸化至少部分传导TGF-β1的作用,抑制活性氧基团、TNF-α和IL-1β的产生和表达。Smad3磷酸化的作用可以被LY-364947阻断。LY-364947抑制Smad3磷酸化,但是不能完全抑制TGF-β1的作用。二、在肺缺血再灌注损伤过程中Smad3磷酸化对细胞凋亡的影响研究目的:凋亡是肺缺血再灌注损伤中细胞死亡的重要形式。在第一部分的研究中我们发现Smad3磷酸化可以抑制活性氧基团,TNF-α以及IL-1β的表达和释放。因此我们假设Smad3磷酸化减轻肺缺血再灌注损伤,抑制细胞凋亡。并对此进行验证。研究方法:建立稳定的大鼠肺缺血再灌注损伤中的模型,40只SD大鼠随机分为4组:SO组,IR组,T组和L组。各组在在缺血再灌注10mins前均经颈静脉注射肝素100U/kg,T组同时注射TGF-β1(10ug/kg),L组同时注射TGF-β1(10ug/kg)和LY-364947(1mg/kg)。在再灌注结束时获取肺标本分别制成组织切片和组织匀浆。用HE染色观察肺组织损伤,TUNEL染色法检测细胞凋亡。用ELISA法测定组织匀浆的pSmard3浓度。研究结果:肺缺血再灌注损伤时Smad3磷酸化激活(48.482±19.602)。TGF-β1增强Smad3磷酸化的激活(63.607±17.194),T组凋亡指数(10.500±4.127)予IR组相比明显下降(18.042±4.789)。LY-364947抑制Smad3磷酸化(13.763±8.732),L组凋亡指数比T组明显升高(14.276±3.705 vs 10.500±4.127).研究结论:在肺缺血再灌注损伤过程中Smad3磷酸化是重要的自我修复的机制之一,随着Smad3磷酸化增强,细胞凋亡明显减少。LY-364947抑制Smad3磷酸化,但是不能完全抑制细胞凋亡的改变趋势。