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骨质疏松患者在全球范围内约有2亿人,在常见病、多发病中位居第七。根据WHO的调查显示,骨质疏松症将是继心血管疾病后第二大医疗问题。骨质疏松症的诊断和预后监测,目前主要以骨密度（BMD）检测为诊断标准。骨密度只能静态的反应骨的形态,但是骨量的变化无法检测。鉴于骨代谢的动态监控一直以来缺乏精准特异的生物学标志物,骨代谢生物标志物是近十年来的一个研究热点。最近已发现有明确意义的骨代谢标志物有:骨钙素（BGP）、甲状旁腺激素（PTH）、总Ⅰ型胶原氨基端延长肽（P1NP）、25-羟基维生素D（25-OH VD）。这些标志物可从完整的骨组织水平精确地评价骨转换效率,从而实现骨质疏松在临床上的定量辅助诊断。但是如何实现这些生物标志物的临床检测以及标志物与疾病的临床价值仍是一个难点,主要原因是骨代谢标志物的抗体获取困难,以及检测方法学的不成熟。在中国,由于上述技术难点,导致国内外能够生产供应骨代谢检测试剂项目的企业只有瑞士的罗氏诊断公司。这对我国有明确价值的骨代谢标志物的推广有极大的限制,对于广大患者经济上是一个很大的负担,无法惠及广大患者。本论文针对骨代谢生物原材料获取困难,采用多肽免疫得到一对P1NP单克隆抗体,同时利用大肠杆菌表达体系成功表达出P1NPα1链,从肿瘤病人的胸积液中纯化出天然的P1NP蛋白;利用VD3成功免疫得到高特异性和亲和力的维生素D抗体。依托化学发光免疫分析技术平台,开发了骨代谢标志物化学发光免疫检测试剂,并测试了临床样本,和罗氏检测的结果比对相关性高。同时还收集了大量不同诊断患者的样本,测试骨钙素和25-羟基维生素D两个指标。通过对数据分析,能够对临床诊断和治疗产生一定的指导意义。针对肺移植病人术前和术后,测定了骨代谢标志物的指标,研究发现相对于传统的骨密度检测,骨代谢标志物能更好的监控骨量在一定阶段内的动态变化,对肺移植病人术后骨质疏松的诊断和治疗有着重大的意义。本论文主要研究内容为以下几个部分:（1）建立骨代谢标志物临床检测方法需用的关键生物原材料制备技术通过构建大肠杆菌的P1NP表达系统,表达P1NP蛋白的α1链,用于后续的抗体筛选。成功从人的胸积液中分离纯化天然的P1NP蛋白,用于抗体的筛选和校准品的制备。通过设计三条不同的α1链短肽免疫小鼠,筛选得到的P1NP单克隆抗体用于下一步试剂的开发。维生素D抗体的开发采用类似的方法,用VD3抗原去免疫小鼠,筛选纯化得到的维生素D单克隆抗体用于临床检测方法学的研究。（2）建立了骨代谢标志物全自动化学发光检测方法分别建立骨钙素（BGP）、甲状旁腺激素（PTH）、总Ⅰ型胶原氨基端延长肽（P1NP）、25-羟基维生素D（25-OH VD）化学发光检测方法。BGP试剂的精密度均小于10%,回收率在100%±10%的范围内,通过加速测试7 d,发光值的降低水平在10%的范围内。骨钙素试剂与罗氏试剂的方法学比对,相关系数R2为0.98,和罗氏结果的相关性非常好。当样本骨钙素的含量高达4000 ng·m L-1时,未发现钩状效应存在。P1NP试剂线性因子r大于0.99,最低检测限为3.11 ng·m L-1。三批P1NP试剂的批间和批内精密度CV均低于10%。当样本中P1NP的浓度大于4000 ng·m L-1时,未发现钩状效应存在。同罗氏P1NP试剂的方法学比对结果显示,相关系数R2为0.98,一致性很好。25-OH VD试剂批间和批内的精密度均小于10%,回收率在100%±10%范围内。加速稳定性发光值的降低在10%以内。将开发的试剂分别于罗氏和Dia Sorin检测的样本进行结果比对,与罗氏比对的相关系数R2为0.9;与Dia Sorin比对的相关系数R2为0.93,相关性高。同时将罗氏,Dia Sorin与本研究建立的方法与金标准液相质谱进行比对,罗氏与液相质谱比对的斜率为1.1,相关系数R2为0.80,Dia Sorin与液相质谱比对的斜率为0.8,相关系数R2为0.79,研究建立的方法与液相质谱比对的斜率为0.79,相关系数R2为0.90。综合结果来看,本研究建立的检测方法已超越了两个国外的产品。PTH试剂的最低检测限为0.2 pg·m L-1,线性因子r大于0.99,三个不同浓度样本的精密度均小于10%,通过与罗氏PTH试剂的方法学比对,斜率为0.99,相关系数R2为0.96,与罗氏的结果一致性很高。（3）研究了骨代谢标志物与临床疾病的关系研究了骨钙素和25-羟基维生素D与临床各种疾病的关系。女性高骨钙素含量的人群多为肥胖（24%）和肿瘤（51%）;而男性高骨钙素含量的人群分布更多的是在肿瘤（56%）和心脑血管疾病（32%）。研究发现测试25-羟基维生素D的患者中,94.98%的患者25-羟基维生素D的浓度低于30 ng·m L-1（参考值为30 ng·m L-1）。这些低维生素D含量的人群中,50%的病人为肥胖症患者;约20%为癌症患者;14%为骨折患者。通过对不同人群的25-羟基维生素D含量的分布统计,结果显示人体内25-羟基维生素D的含量可能与肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病和骨关节炎这些疾病有密切的关系。本研究还首次建立了P1NP男性参考值区间。首次研究了骨代谢标志物和肺移植的关系。用本项目开发的骨代谢检测试剂定期追踪并检测肺移植患者术前和术后骨代谢标志物含量的变化。结果表明,在短时间的骨量监控上,骨代谢标志物能够更好的提示骨量的变化,而传统的骨密度检测要滞后于骨代谢标志物,这对于临床的诊断治疗有着非常大的意义。