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第一部分 年幼至年老大鼠海马结构神经元细胞核大小的体视学研究目的:定量研究大鼠从出生后15天至36月龄海马结构及其主要功能亚区神经元细胞核体积和直径的增龄性变化,旨在确定大鼠年轻至年老过程中海马结构及其主要功能亚区的神经元细胞核是否发生萎缩。方法:从15日龄、3月龄、12月龄、24月龄及36月龄的同群正常雄性Sprague-Dawley大鼠中随机抽选动物,每个年龄组5只,灌注固定后取出大脑,每组轮流抽选左侧或右侧大脑半球,然后完整剥离海马结构,用甲基丙烯酸树脂包埋后作连续切片(切片厚度40 μm),等距随机抽选3—4张切片,过碘酸、席夫试剂和苏木精染色。用体视学方法估计海马结构及其主要功能亚区内神经元细胞核的大小:首先,用光学体视框均匀随机抽选神经元细胞核,然后在其最大轮廓的聚焦平面(光学切片)测其Feret直径作为细胞核直径,最后,在其核仁的最清晰聚焦平面用核距测量法测其体积。结果:1.大鼠海马结构内的神经元细胞核平均体积在15日龄最大,为642±27μm3,从15日龄体积开始呈减小趋势,3月龄、12月龄、24月龄和36月龄较15日龄分别显著减少了 16%、36%、29%和39%(P<0.05),12月龄、24月龄和36月龄与3月龄核平均体积比较差异有统计学意义(P<0.05),12月龄至36月龄核平均体积变化差异无统计学意义(P>0.05),核平均体积在36月龄最小,为392±24μm3;神经元细胞核平均直径在15日龄最大,为9.93±0.12μm,从15日龄直径开始呈减小趋势,3月龄、12月龄、24月龄和36月龄较15日龄分别减少2.8%、11.1%(P<0.05)、7.0%(P<0.05)和 12.5%(P<0.05);12 月龄、24 月龄和 36月龄较3月龄神经元细胞核平均直径分别减少8.2%(P<0.05)、4.3%和9.9%(P<0.05)。2.大鼠CA区的神经元细胞核平均体积在15日龄最大,为744±31μm3,15日龄至3月龄基本不变,从3月龄开始呈减小趋势,12月龄、24月龄和36月龄较15日龄和3月龄的核体积平均值分别显著减少了约26%、17%、26%(P<0.05),12月龄至36月龄的神经元核平均体积差异无统计学意义(P>0.05),核平均体积在12月龄最小,为538±38μm3。神经元细胞核平均直径从15日龄开始轻微增大,至3月龄到达最大10.81±0.07μm,之后开始减小,12月龄、24月龄和36月龄较3月龄神经元核平均直径分别减少8.1%(P<0.05)、3.7%和9.1%(P<0.05)。3.大鼠DG区的神经元细胞核平均体积在15日龄最大,为41 7±19μm3,从15日龄开始呈减小趋势,3月龄、12月龄、24月龄和36月龄较15日龄分别显著减少了 20%、41%、35%和46%(P<0.05),12月龄、24月龄和36月龄与3月龄核平均体积比较差异有统计学意义(P<0.05),12月龄至36月龄核平均体积变化差异无统计学意义(P<0.05),核平均体积在36月龄最小,为227±11μm3。神经元细胞核平均直径在15日龄最大,为8.63±0.14μm,从15日龄开始呈减小趋势,3月龄、12月龄、24月龄和36月龄较15日龄神经元核平均直径分别减少 3.4%、11.2%(P<0.05)、9.3%(P<0.05)和 13.4%(P<0.05),12 月龄、24月龄和36月龄较3月龄神经元细胞核平均直径分别减少8.0%(P<0.05)、6.1%(P<0.05)和 10.3%(P<0.05)。4.大鼠S区的神经元细胞核平均体积在15日龄最大,为690±59μm3,3月龄、12月龄、24月龄和36月龄与15日龄核平均体积比较差异均无统计学意义(P>0.05);神经元细胞核平均直径在15日龄最大,为10.16±0.24μm,3月龄、12月龄、24月龄和36月龄与15日龄核平均直径比较差异均无统计学意义(P>0.05)。5.海马各区神经元细胞核平均直径与其神经元细胞核平均体积的变化趋势基本一致。第二部分 不同固定方法对大鼠海马结构神经元细胞核大小的影响目的:为了确定不同年龄大鼠海马结构神经元细胞核大小的变化是否与不同的灌注方法(15日龄和3月龄为浸润固定,12、24和36月龄为灌注固定)有关,我们定量研究灌注固定和浸润固定后大鼠海马神经元细胞核的体积和直径变化,旨在确定灌注固定和浸润固定是否会对大鼠海马神经元细胞核大小产生影响。方法:将12只体重201.8±4.4 g的3月龄正常雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为两组:灌注固定组和浸润固定组,每组各6只,一组经心脏灌注固定后取出大脑,另一组不灌注直接取出大脑后将大脑浸润固定,然后完整剥离海马结构,并将海马结构沿垂直于C形海马长轴线横切成厚度大致相等的6块,等距随机抽选3块,之后将3块海马组织用甲基丙烯酸树脂包埋在一个组织块,每个组织块切一张切片(切片厚度40μm),行过碘酸、席夫试剂和苏木精染色。用体视学方法估计CA锥体层神经元和DG颗粒层神经元的细胞核体积:首先,用光学体视框等距随机抽选锥体层和颗粒层神经元细胞核,然后,在其最大轮廓的聚焦平面(光学切片)测其横径,最后,在其核仁的最清晰聚焦平面用核距测量法测其体积。结果:1.灌注固定组与浸润固定组的大鼠海马CA锥体细胞核平均体积分别为735±50μm3和767±38μm3,两组的差异无统计学意义(P>0.05);灌注固定组与浸润固定组的大鼠海马DG颗粒细胞核平均体积分别为374±20μm3和422±11μm3,两组的差异无统计学意义(P>0.05)。2.灌注固定组与浸润固定组的大鼠海马CA锥体细胞核平均直径分别为10.73±0.3μm和10.93±0.39μm,两组的差异无统计学意义(P>0.05);灌注固定组与浸润固定组的大鼠海马DG颗粒细胞核平均直径分别为8.74±0.23μm和9.1±0.15μm,两组的差异无统计学意义(P>0.05)。全文结论:1.本研究发现海马结构、CA和DG内的神经元细胞核平均体积随着年龄的增长而显著减小,S区内神经元细胞核平均体积无显著变化,其中DG区的神经元细胞核的平均体积在3月龄开始出现显著性减小,而CA区的神经元细胞核平均体积则在12月龄出现减小,之后CA和DG到24月龄均出现轻微增大,36月龄降至最低,说明海马结构的某些特定区域的神经元细胞核体积随着年龄的增长出现萎缩,并且不同功能亚区的神经元细胞核发生萎缩的年龄也不一样,而这种区域差异性可能是由于海马不同亚区对内、外环境影响所表现的神经可塑性差异导致的。另外,CA和DG区的神经元细胞核体积在24月龄的轻微增大,之后在衰老晚期(36月龄)CA和DG区的神经元细胞核体积均缩小至最低,这可能提示,海马神经元的某些功能(例如细胞兴奋性)从12月龄至24月龄有一定程度的代偿性增加。HF及其亚区CA区、DG区神经元细胞核体积12月龄~36月龄未发生显著变化,表明:从中年到老年,大鼠整个海马内神经元的细胞核大小,总的来说没有年龄相关变化,这提示,大鼠老年学习与记忆功能减退,如果存在的话,可能与整个海马神经元细胞核的萎缩无关,或者说未必伴有神经元整体功能的减退,尽管这并不排除部分神经元的部分形态或功能改变的可能。2.海马神经元细胞核的直径与其细胞核体积呈正相关,提示神经元细胞核的直径可以反映细胞核体积的大小。3.灌注固定和浸润固定这两种固定方法对大鼠海马神经元细胞核大小没有显著性影响,值得注意的是,海马结构经灌注固定后其海马神经元细胞核大小会相比浸润固定后偏小些,尽管差异无统计学意义。