【摘 要】
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目的:观察人退变髓核细胞在体外培养条件下经不同剂量柚皮苷、自噬抑制剂干预后自噬的活跃程度与状态。探索人退变髓核细胞自噬活性是否和细胞衰老、代谢水平存在关联性。基于中医“补肾活血”理论研究柚皮苷是否通过影响自噬的水平而拮抗髓核细胞衰老和代谢不足、分解酶分泌异常和细胞外基质降解,从而发掘柚皮苷的潜在治疗效果,为中药治疗椎间盘退变提供新的研究方向。方法:根据排除和纳入标准,选取2021年2月～2021年
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目的:观察人退变髓核细胞在体外培养条件下经不同剂量柚皮苷、自噬抑制剂干预后自噬的活跃程度与状态。探索人退变髓核细胞自噬活性是否和细胞衰老、代谢水平存在关联性。基于中医“补肾活血”理论研究柚皮苷是否通过影响自噬的水平而拮抗髓核细胞衰老和代谢不足、分解酶分泌异常和细胞外基质降解,从而发掘柚皮苷的潜在治疗效果,为中药治疗椎间盘退变提供新的研究方向。方法:根据排除和纳入标准,选取2021年2月～2021年12月于山东中医药大学附属医院正在接受椎间盘手术的腰椎间盘突出患者10人（中医辩证为肾虚血瘀型）,体外分离髓核组织后提取人退变髓核细胞;采用CollagenⅡ染色鉴定髓核细胞表型;CCK8法筛选柚皮苷干预髓核细胞的最适浓度;根据等差浓度梯度设置分组:低剂量柚皮苷干预组、中剂量柚皮苷干预组、高剂量柚皮苷干预组、自噬抑制剂组;采用透射电镜和自噬腺病毒载体p AV-CMV-Tag RFP-SEP-LC3转染示踪髓核细胞自噬小体的变化;采用β-半乳糖苷酶染色观察髓核细胞衰老的表达;采用ATP含量比色法观察髓核细胞生成ATP的含量;采用RT-PCR技术检测分解酶MMP-3、细胞外基质CollagenⅡ的相对基因表达量;采用Western blot法分析自噬发生蛋白LC3和Beclin-1、自噬降解蛋白P62、MMP-3和CollagenⅡ的相对蛋白表达量。结果:1.CollagenⅡ染色结果鉴定所培养细胞系人髓核细胞;2.经CCK8法测得柚皮苷干预髓核细胞的最适浓度为10μg/m L,遂进行分组:低剂量柚皮苷干预组（5μg/m L）、中剂量柚皮苷干预组（10μg/m L）、高剂量柚皮苷干预组（15μg/m L）、自噬抑制剂组（10μM 3-MA）;3.透射电镜结果显示:相比自噬抑制剂组,低、中、高剂量柚皮苷干预组中存在更多的双层膜自噬小体;4.自噬腺病毒载体转染结果显示:相对低剂量柚皮苷干预组,中剂量柚皮苷干预组中绿色荧光斑点数量显著增加（p﹤0.05）,而自噬抑制剂组绿色荧光斑点数量显著降低（p﹤0.001）,高剂量柚皮苷干预组绿色荧光斑点数量无显著差异（p﹥0.05）;5.自噬发生蛋白LC3和Beclin-1检测显示:相对低剂量柚皮苷干预组,中剂量柚皮苷干预组显著增加了LC3Ⅱ/Ⅰ的比值（p﹤0.05）,而自噬抑制剂组显著抑制了LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和Beclin-1的表达量（p﹤0.05,p﹤0.01）,其余各组均无显著差异（p﹥0.05）;6.自噬溶酶体降解蛋白P62检测显示:相对低剂量柚皮苷干预组,自噬抑制剂组显著增加了P62的表达量（p﹤0.001）,中剂量柚皮苷干预组和高剂量柚皮苷干预组则无显著差异（p﹥0.05）;7.β-半乳糖苷酶染色结果显示:与低剂量柚皮苷干预组相比,自噬抑制剂组显著加剧了髓核细胞衰老（p﹤0.05）;8.ATP含量比色法结果显示:与低剂量柚皮苷干预组相比,中剂量柚皮苷干预组显著增加了ATP的合成（p﹤0.05）,自噬抑制剂组则显著抑制了ATP的生成（p﹤0.05）;9.RT-PCR结果显示:与低剂量柚皮苷干预组相比,中剂量柚皮苷干预组显著增加了外基质CollagenⅡ的合成（p﹤0.05）,自噬抑制剂组显著抑制了外基质CollagenⅡ的合成并促进了分解酶MMP-3的表达（均p﹤0.01）;10.Western blot结果显示:与低剂量柚皮苷干预组相比,中剂量柚皮苷干预组显著增加了外基质CollagenⅡ的合成和抑制了分解酶MMP-3的表达（p﹤0.001,p﹤0.05）,而自噬抑制剂组显著抑制了外基质CollagenⅡ的合成并促进了分解酶MMP-3的表达（p﹤0.01,p﹤0.05）;11.综上,中剂量（10μg/m L）柚皮苷干预人退变髓核细胞效果最佳。结论:1.柚皮苷诱导人退变髓核细胞自噬表达升高,并促进了自噬流的通畅;2.柚皮苷通过增加人退变髓核细胞自噬水平而拮抗髓核细胞衰老和促进髓核细胞的基础代谢,从而抑制了分解酶的表达而增加了细胞外基质的合成。
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