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背景阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种超级罕见病,国内缺乏大宗病例报道,尤其缺乏针对不同亚型的分析。PNH克隆扩增、PNH血栓形成的分子机制仍尚无定论。目的分析PNH患者的临床特征,并比较不同亚型PNH的特点。探索PNH克隆增殖及易发血栓的机制。方法1.收集2009年至2019年在北京协和医院就诊并随访2年以上的PNH患者的资料进行统计学分析。记录诊断时及随访过程中的实验室相关临床资料、药物治疗、克隆演变、疾病预后及女性PNH患者妊娠分娩等情况。2.采集6例PNH患者外周血粒细胞,分选出CD59阳性和CD59阴性细胞,并分别送检全外显子、全转录组测序,同时采集6例健康对照的外周血作为对照。筛出同时具有WES与转录组异常的基因进行GO富集,关注与增殖凋亡、免疫及血栓相关的基因。3.后续将以上基因在40例PNH患者外周血细胞WES测序的结果库中进行筛选,找出同时满足千人库频率低于0.001且在PNH中发生率≥10%的基因作为候选基因。将前述候选基因在另外40例PNH外周血样本中进行一代测序验证,最终确定目标基因。4.随后收集7例PNH患者外周血粒细胞,分选CD59阳性和CD59阴性细胞,采用Q-PCR检测其目标基因的RNA表达,用Western Blot、流式及质谱检测目标蛋白表达。结果1.研究共纳入512例患者,其中男性288例（56.3%）,女性224例（43.7%）,发病年龄中位数为33岁（9~80岁）。经典型PNH、合并骨髓衰竭型（BMF）/PNH和亚临床PNH患者比例分别为46.8%、51.6%和1.6%。经典型PNH患者临床症状更多与溶血相关,而出血症状则在BMF/PNH患者中更常见。与BMF/PNH患者相比,经典型PNH患者的PNH克隆、乳酸脱氢酶（LDH）水平更高,铁蛋白水平更低。虽然经典型PNH和BMF/PNH患者发生血栓比例相似（P=0.66）,但BMF/PNH患者发生肾损害的几率更高（P＜0.05）。BMF/PNH患者中使用免疫抑制剂（P＜0.05）更多,而经典型PNH患者使用糖皮质激素、铁补充剂和抗凝剂（P＜0.05）更多。对免疫抑制剂治疗无效患者比治疗有效患者的PNH 克隆更大（66.89±35.01%vs 38.64±30.47%,P=0.001）;治疗效果稳定（诊断 vs 末次随访:38.64±30.47%vs 39.50±43.13%,P=0.829）及治疗无效（诊断 vs 末次随访:68.89±35.01%vs 96.00±1.00%,P=0.133）患者在随访过程中的PNH克隆稳定;起初治疗有效但随访过程中复发患者的复发后PNH克隆较复发前显著增加（43.53 ± 30.96%vs 93.33±3.22%,P＜0.01）。与BMF/PNH相比,经典型PNH发生髓系恶性肿瘤几率更低（P=0.02）。PNH患者主要死亡原因为血栓（29.6%）、出血（18.5%）和感染（18.5%）,经典型PNH和BMF/PNH在死亡原因方面无差异。与BMF/PNH患者相比,经典型PNH患者的总生存较好,BMF/PNH中MDS/PNH的预后最差。2.经GO富集发现,同正常人相比,PNH患者T细胞活化相关基因上调。血小板脱颗粒,凝血、止血,白细胞增殖,血小板活化相关基因下调。对比CD59+和CD59-细胞,发现CD59+细胞中白细胞增殖、细胞凋亡调控、免疫活化及血小板活化、凝血调节相关基因较CD59-细胞下调。3.在初步筛选目的基因中,包括增殖凋亡相关基因416个,免疫相关基因716个,血栓相关基因共141个。这些基因经40例PNH患者WES测序结果库筛选后,共获得10个目标基因。再经Sanger测序验证靶点突变有SELP（突变率12.5%）、NRP1（10%）、SLC15A4（5%）、vWF（2.5%）、ABCA13（2.5%）和 FLT1（2.5%）,靶点外碱基突变有SWAP70（62.5%）和 EpHB2（10%）。其中 SWAP70、EPHB2、ABCA13、SLC15A4基因突变率在血栓组显著高于非血栓组（P＜0.05）。最终确定SELP、NRP1、vWF、FLT1、SWAP70和EpHB2这6个为目的基因。4.从Q-PCR和蛋白水平验证目的基因,发现PNH在RNA和蛋白水平均与健康对照有差异的基因为NRP1和EpHB2;仅在RNA水平与健康对照存在差异的是SELP;仅在蛋白水平与健康对照有差异的是FLT1和vWF;在RNA和蛋白质水平与健康对照均无差异,但在CD59+和CD59-之间存在差异的基因是SWAP70。以上差异基因中,EpHB2、NRP1及FLT1与增殖、凋亡相关;SELP、vWF和EpHB2与血栓相关;SWAP70与免疫相关。EpHB2、NRP1、FLT1和SWAP70在CD59+和CD59-细胞之间也有差异表达。质谱分析还发现CD59+细胞存在抗增殖蛋白（BTG1）表达,而CD59-细胞有存在细胞周期相关蛋白（INCA1、NPEPPS）表达。结论1.经典型PNH表现出更多与溶血相关的症状和并发症,并且PNH克隆更大。经典型PNH以支持治疗为主,而BMF/PNH以免疫抑制治疗为主,且免疫抑制治疗效果与PNH克隆大小相关。BMF/PNH 比经典型PNH预后更差。2.同正常人相比,PNH患者T细胞活化相关基因上调,增殖、出凝血相关基因下调。其中,CD59+细胞增殖和血栓调节基因下调更为明显。3.筛选出的PNH高发基因,在RNA和（或）蛋白水平表达与正常人也不同,且在CD59+和CD59-细胞间表达存在差异,部分还在PNH血栓组高发。这些可能是PNH的血栓、CD59-细胞的增殖相关的重要基因。4.CD59+细胞存在抗增殖蛋白表达,而CD59-细胞存在细胞周期相关蛋白表达,考虑是参与PNH克隆增殖的因素。全文结论PNH发病年龄轻,PNH发生血栓风险高且预后不佳,免疫抑制剂治疗效果与PNH克隆大小相关。PNH患者基因组存在增殖能力下调,免疫活化上调,凝血相关下调,且增殖凋亡、免疫及凝血功能相关基因、蛋白表达异常,且在不同细胞亚群中存在差异。在PIGA之外的一些基因的异常表达可能与PNH克隆增殖和血栓形成密切相关。