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β-半乳糖苷酶通用名称为乳糖酶,属于糖苷水解酶类,可将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,并可以通过转糖苷作用合成低聚糖。乳糖酶不仅可缓解乳糖不耐受症,还可改良乳制品的品质、风味和口感。本研究采用基因工程技术对一株卷曲乳杆菌B164中的乳糖酶进行了基因克隆、表达和酶学性质分析,进一步地研究了其用于生产低乳糖牛奶的实际效果,结果如下：1.经16S rDNA序列比对,菌株B164鉴定为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。采用简并引物PCR和热不对称交错PCR (TAIL-PCR)的方法从菌株B164基因组中克隆得到乳糖酶基因bg42-164。该基因全长2031bp,编码676个氨基酸和一个终止密码子,无信号肽序列。经序列比对分析,bg42-164属于糖苷水解酶GH42家族。2.乳糖酶基因bg42-164连接pET-30a(+)表达载体并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中得到活性表达,对重组表达的乳糖酶蛋白进行了纯化和酶学性质分析。乳糖酶蛋白BG42-164的分子量约为66 kD,最适反应温度50℃,最适pH 6.0,热稳定性较好,47℃处理30min,仍有90%以上的相对酶活力。Mg2+、Mn2+、Zn2+对BG42-164乳糖酶活性有显著的激活作用,而Cu2+,K+和SDS对酶活有较强的抑制作用。乳糖酶BG42-164的比活为159.77 U·mg-1,以邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷(oNPG)为底物,在50℃,pH6.0条件下,其Km=3.559 m mol·L-1, Vmax=19.231 n mol·min-1。将bg42-164基因连接pPIC9表达载体并转化毕赤酵母GS115,未能得到分泌表达。3.于牛奶中添加不同量的乳糖酶BG42-164,在50℃,37℃和18℃的条件下对牛奶中的乳糖进行水解。当酶活为5000 U·mL-1的乳糖酶取0.1mL添加到2 mL牛奶后,50℃下处理2h,牛奶中的乳糖全部水解；37℃下处理6h,乳糖水解率达到99%；18℃水解9h,乳糖水解率也能达到60%。综合考虑,乳糖酶BG42-164水解牛奶的优化工艺条件为：温度为50℃,5000U·mL-10.1mL乳糖酶添加到2mL牛奶中,水解2 h。