抗体是由脊椎动物产生的一种能高亲和力、特异性识别抗原的多功能分子。在植物保护领域,抗体即可作为农药残留免疫分析的生物识别分子,又可用于农药的分子模拟,替代其与靶标昆虫受体结合,甚至引发生物学效应。本研究从抗体的生物识别和分子模拟两大功能着手,开展了多种拟除虫菊酯农药共性代谢产物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）免疫分析技术研究。同时采用抗独特型抗体技术对苏云金芽孢杆菌（Bt）Cry2Aa毒素进行分子模拟,并对其生物活性与原毒素进行比较研究,具体取得的结果如下:（1）3-PBA胶体金免疫层析法的建立试验采用体内诱生腹水法制备了 3-PBA单克隆抗体,并用Protein G柱进行亲和纯化。用间接竞争ELISA法测定的3-PBA对纯化抗体的抑制中浓度（I50）为0.63 μg/mL,最低检测限（110）为0.13μg/mL,线性检测范围（I20-I80）在0.19-2.04μg/mL之间。用柠檬酸三钠还原法制备了 15nm的胶体金颗粒用于纯化抗体标记,测定的最佳抗体标记浓度为48μg/mL。试验以硝酸纤维素膜为载体,组装了免疫层析试纸,优化的检测线浓度和金标抗体喷膜量分别为2 mg/mL和5μL/cm。以检测线完全抑制为标准,免疫层析试纸对3-PBA的检测阈值为1μg/mL,检测时间为10min。采用免疫层析试纸对40个添加了不同浓度3-PBA的水样进行测试,结果表明假阴性率为2.5%,未观察到假阳性结果。该方法有潜力用于水体等环境样本中3-PBA的现场快速检测。（2）3-PBA单链抗体的构建及生物信息学分析本研究以实验室保存的一株能识别3-PBA的鼠杂交瘤细胞株为模板,提取其总RNA,反转录为cDNA第一链。采用简并引物,PCR法扩增鼠抗体重链可变区（VH）和κ轻链可变区（Vκ）基因。再用重叠延伸PCR法,将VH、Vκ基因与一个45 bp的linker进行连接。克隆至pET26b（+）载体后,化转E.coli BL21（DE3）。单链抗体株小量诱导表达后,用ELISA法和Western blot验证了对3-PBA的结合活性。试验随后通过ExPASy和IMGT生物信息学网站对单链抗体的理化性质、二级结构、等位基因及功能区进行预测与分析。结果表明3-PBA单链抗体计算分子量为29905.61 Da,理论等电点为8.95,为亲水性、不稳定蛋白。单链抗体基因全长840bp,VH和Vκ分别为370bp和319bp。与编码VH和Vκ的可变区基因片段一致性最高的等位基因分别为Musmus IGHV1-18*01 F或Musmus IGHV1-22*01 F 和 Musmus IGKV4-72*01 F。VH 和 Vκ 的 3 个互补决定区（CDR区）长度分别为8-8-16和5-3-9。相比于胚系基因,单链抗体CDR区的总氨基酸突变率为20%。试验通过SWISS-MODEL软件对单链抗体同源建模,用Autodock Vina软件对单链抗体和3-PBA进行分子对接,发现单链抗体与3-PBA之间存在氢键、疏水作用、CH-π作用和阳离子-π作用。参与抗原识别的关键氨基酸位点包括 GLY-74,ASN-76,GLU-81,VAL-123,LEU-130,TRP-252 和ARG-83,这些氨基酸均位于IMGT标注的抗体CDR区及其邻近区域。本试验首次成功构建了能识别3-PBA的单链抗体,为后期表达和检测应用奠定了基础。另外试验分析和预测了参与3-PBA识别的抗体关键氨基酸位点及其相互作用力,合理的解释了单链抗体与3-PBA的结合模式,为抗体的进一步优化和生产提供了重要的参考信息。（3）3-PBA单链抗体的表达、功能分析与检测应用试验考察了温度、诱导剂浓度和诱导时间,对3-PBA单链抗体表达的影响。结果表明,16℃的诱导温度,终浓度0.25 mM IPTG和8h诱导时间为优化的单链抗体表达条件。单链抗体大量表达后,包涵体用镍离子亲和柱进行纯化,用200 mM的咪唑进行洗脱,获得了电泳纯的蛋白,得率为2.68 mg/L,并进行尿素溶解和透析复性。试验对包被原及抗体工作浓度和甲醇浓度进行优化后,建立了基于单链抗体的3-PBA间接竞争ELISA检测方法,计算得到的抗体抑制中浓度（I50）为0.55 μg/mL,方法的线性检测范围（I20-I80）在0.15-2.64 μg/mL之间,最低检测限（110）为0.05μg/mL,3-PBA单链抗体的灵敏度比其母本单克隆抗体有所提高。单链抗体对甲氰菊酯、高效氯氰菊酯和氰戊菊酯仅有0.56%-1.15%的交叉反应,但对3-苯氧基苯甲醛和3-苯氧基苯甲醇的交叉反应率高达93.22%和87.30%,单链抗体也可用于这两种菊酯代谢物的快速筛查检测。单链抗体在4℃保存的半衰期在14-21天之间,-20℃和-80℃下保存3个月未发现结合信号下降,具有较好的稳定性。通过对自来水样的添加回收试验,ELISA法的平均回收率在83%-96%之间,平均批内和批间变异系数分别在1.78%-8.54%和4.65%-10.56%之间,与HPLC法的相关性R2为0.9892。该方法有潜力替代色谱法用于水体等环境样品中3-PBA的快速筛查检测。（4）基于链替换技术的Cry2Aa抗独特型单链抗体的构建与筛选通常从非免疫抗体库中直接筛选抗独特型抗体,得到的阳性克隆数量较少甚至无法获得。实验室前期从人源半合成抗体库（Tomlinson Ⅰ库）中筛选得到两株苏云金芽孢杆菌（Bt）Cry2Aa毒素的抗独特型单链抗体（B10和F2）。为了获得更多的抗独特型单链抗体,本研究以B10、F2为模板,采用链替换技术,分别构建了库容为1.4×106和1.2×106的Cry2Aa抗独特型单链抗体的重链和轻链替换库。通过多克隆噬菌体ELISA分析发现,轻链替换库的整体亲和力是重链替换库的4.2倍。试验用Cry2Aa多抗为筛选抗原,分别对重、轻链替换库进行了 1轮筛选,筛选阳性率分别为13.6%和57.4%,经过测序最终获得1个重链替换突变体和6个轻链替换突变体。试验采用竞争性噬菌体ELISA测定了突变体与筛选抗原的表观亲和力,其中最佳克隆MUT10的表观亲和力为1.42×106 M-1。竞争抑制试验表明,100 μg/mL的Cry2Aa对MUT10和Cry2Aa多克隆抗体的结合最高可产生30.1%抑制,50 μL的MUT10培养上清对Cry2Aa与其多抗产生了46.7%的抑制。MUT10为部分抑制型抗独特型抗体,模拟了 Cry2Aa毒素的部分结构特征。本研究为Cry2Aa抗独特型单链抗体的生物活性测定提供了基础材料。（5）Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾生物活性的初步分析本研究在前期获得Cry2Aa抗独特型单链抗体的基础上,测试和比较了Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对常见鳞翅目靶标害虫小菜蛾的生物活性。试验首先采用ELISA法测定了 Cry2Aa与小菜蛾刷状缘膜囊泡（BBMV）的结合曲线,通过Scatchard模型回归分析,计算得到的表观结合亲和力为266.6nmol/L。同时用ELISA法测定了 9种Cry2Aa抗独特型单链抗体与小菜蛾BBMV的结合活性,结果表明抗独特型单链抗体MUT10与BBMV存在最高的特异性结合。试验利用浸叶法测定了 Cry2Aa对小菜蛾的半数致死浓度（LC50）为27.90 μg/mL,而107cfu/mLMUT10对小菜蛾的矫正死亡率为12.8%。试验用Ligand blot分析了 Cry2Aa、MUT10与小菜蛾BBMV的结合蛋白,并对245 kDa上方的一条共同结合条带进行了 LC-MS/MS分析。结果表明,该条带酶解后得到ATYSEGPNGSVR片段,通过数据库比对分析,匹配到一个分子量为332kDa的小菜蛾未鉴定蛋白,其功能注释为脂质运载蛋白。本研究为Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾作用机理的阐明提供了有益数据。本研究构建了多种拟除虫菊酯农药共性代谢产物3-苯氧基苯甲酸的新型抗体识别分子,建立了其免疫学分析方法,获得了抗体信息学数据,阐明了其结合模式。另外,试验构建并筛选了能模拟Cry2Aa毒素部分结构特征的抗独特型单链抗体,开展了 Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾生物活性的比较研究,探索了杀虫蛋白资源创制的新思路。