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目的在很多情况下,阿片类药物尤其是吗啡可以起到良好的镇痛作用,然而也因为疗效不甚理想,或者药物副作用、药物耐受、依赖而影响了阿片类药物的使用。如何提高阿片类药物的疗效并降低其副作用,成为目前临床应用和基础研究所关注的热点。我们采用小鼠吗啡依赖模型,研究褪黑素(melatonin,MT)抗吗啡依赖的作用,探究MT与脑内吗啡依赖相关核团或脑区的褪黑素受体、吗啡受体以及神经营养因子、神经生长因子等的相互作用关系,阐明MT抗吗啡依赖作用及可能机制,为MT及其同系物可能作为戒毒新药或用于戒断辅助治疗应用于临床提供动物学实验依据,并加深对药物成瘾的分子神经生物学机制的认识。方法与材料将实验小鼠分为生理盐水(空白对照,NS)组、吗啡(病理对照,MP)组、褪黑素(治疗,MT)Ⅰ-Ⅲ组。吗啡组小鼠采用腹腔给药方式注射吗啡70mg/kg体重(0.5ml),每天早晚各一次,连续7天。生理盐水组小鼠每天早晚腹腔给药方式注射0.5ml生理盐水,连续7天。MT治疗组小鼠采用腹腔给药方式注射吗啡70mg/kg体重,每天早晚各一次,连续7天;同时,每天晚上在吗啡给药的同时腹腔注射MT 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg体重。采用位置偏爱性实验观察各组小鼠在黑箱以及白箱的停留时间以评价和确定小鼠吗啡依赖模型的建立。记录各组实验小鼠给药前后的体重流失情况、跳跃次数、激惹情况等,从行为学方面确定MT对于小鼠吗啡依赖形成的抑制作用。行为学的研究完成后,将实验小鼠处死,取脑,采用免疫组织化学、western-blotting的方法测定各组小鼠相关脑区褪黑素受体-a(MTR-a)、褪黑素受体-b(MTR-b)、吗啡受体-μ(MP-μ)、神经营养因子3(NT-3)、神经生长因子(NGF)的表达差异。结果1.用条件性位置偏爱实验(conditioned place preference,CPP)评价小鼠吗啡依赖的形成。观察到给药后吗啡依赖组小鼠在非偏爱侧(白箱)停留时间较给药前明显延长,小鼠呈现明显的CPP效应。进一步观察小鼠在跳跃次数、激惹情况、体重流失等行为。结果显示,给予MT的小鼠明显优于吗啡组,生理盐水组小鼠给药前后无明显变化。2.组织病理学观察,光镜观察可见,吗啡(病理对照,MP)组小鼠海马组织、伏核、前额皮质等可见不同程度的神经元胞体核质疏松,细胞水肿,气球样变,核固缩、碎裂,甚至变性坏死等。褪黑素(治疗,MT)组和生理盐水(空白对照,NS)组小鼠脑组织未见上述病理改变。免疫组织化学检测,海马(hippocampus)和中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area of midbrain,VTA)MTR-a、MTR-b、MP-μ染色阳性细胞呈单个散在或小群细胞分布,阳性部位主要在胞浆。MP-μ蛋白表达于吗啡组最高,褪黑素组次之,生理盐水组最低;MTR-a、MTR-b蛋白于褪黑素组呈高表达,生理盐水组次之,吗啡组表达最低;与之相应,NGF、NT-3阳性细胞在褪黑素组最高,生理盐水组次之,以吗啡组最低。3.免疫印迹检测海马、前脑和中脑腹侧区MTR-a、MTR-b、MP-μ蛋白表达,结果表明:治疗组MTR-a、MTR-b蛋白呈高表达,吗啡组MP-μ蛋白高表达。讨论与结论建立稳定可靠的小鼠吗啡依赖模型,可以通过行为学、免疫组化、电泳免疫印迹等方法,检测不同脑区内褪黑素受体、吗啡受体及神经生长因子等活性物质,证明MT对于小鼠吗啡依赖形成具有一定的抑制作用,可能一方面通过激活神经细胞分泌神经生长因子,另一方面可能神经细胞表达褪黑素受体拮抗吗啡与其受体的结合,达到抑制吗啡依赖形成和保护神经组织的作用。