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研究目的:人体正常牙髓组织中存在的牙髓干细胞（human Dental pulp stem cells,h DPSCs）,已被作为种子细胞用于组织工程中组织再生,其研究前景良好。有研究表明炎性环境下的牙髓组织中同样存在牙髓干细胞,但其成骨分化能力减弱,若能对这种牙髓干细胞加以利用,则过去因不可逆炎症而需摘除的牙髓组织有望得到保留并发挥一定功能。长链非编码RNA（lnc RNA）参与胚胎发育、炎症、肿瘤等多种生理和病理活动,调控干细胞分化。此外,自噬调控关键靶点m TORC1复合物重要组成——Raptor蛋白已证明可影响牙髓干细胞成骨分化能力。因此,本研究通过GEO数据库筛选出在牙髓干细胞成牙分化中差异性表达的lnc RNA LOC101928855（Raptor反义lnc RNA）后,将进一步探索LOC101928855通过Raptor影响炎性环境牙髓干细胞成骨分化能力的作用机制,为提高炎性来源牙髓干细胞成骨分化能力提供新思路和基础理论依据。研究方法:1.炎性环境下人牙髓干细胞成骨能力和LOC101928855表达情况。人牙髓组织中获得h DPSCs,采用适宜浓度脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激以获得模拟炎性环境下的h DPSCs。比较四组h DPSCs（空白（Control）组、成骨分化培养基（OS）组、LPS处理（LPS）组、LPS处理成骨分化培养基（LPS+OS）组）中的LOC101928855、Raptor及成骨相关基因和蛋白表达情况,荧光原位杂交确定LOC101928855在细胞中定位。2.细胞水平研究LOC101928855调节炎性环境h DPSCs成骨能力的表型和机制探索。构建LOC101928855的过表达和敲减慢病毒,分别在正常和炎性环境下干扰h DPSCs中LOC10192885表达水平,ELISA检测炎性指标;免疫荧光检测自噬指标LC3;电镜下观察自噬体水平,7天和14天时Western blot、RT-q PCR检测成骨和自噬相关因子基因和蛋白表达,茜素红染色,ALP检测干细胞的成骨能力。3.结合NCBI和UCSC数据分析发现Raptor有三个变体,（功能性的V1和V3,非功能性V2）,推测LOC101928855可能通过参与Raptor可变剪切,调节干细胞成骨分化,通过RNA结合蛋白预测网站对LOC101928855进行RNA结合蛋白预测,RT-q PCR对炎性环境下h DPSCs中RNA结合蛋白表达检测,筛选出与目标lnc RNA表达趋势一致的结合蛋白;RNA-pull down,RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）和Western blot实验验证,RNA结合蛋白与LOC101928855可以产生特异性结合;进一步通过基因过表达和干扰技术,RT-q PCR实验,验证了LOC10192885调控RNA结合蛋白对Raptor变体表达的影响。4.体内实验证明LOC101928855可改善炎性环境下h DPSCs成骨能力。将羟基磷灰石（HA）支架复合不同处理的h DPSCs细胞[HA、HA+h DPSCs、HA+h DPSCs（LPS+LOC101928855 sh RNA）、HA+h DPSCs（LPS）]植入4组裸鼠背部皮下,8周后取材行HE染色和碱性磷酸酶活性检测,观察新生骨形成。研究结果:1.体外LPS 1μg/m L刺激h DPSCs模拟炎性环境h DPSCs,LOC101928855高表达,Raptor和成骨相关蛋白因子的基因和蛋白降低,细胞成骨能力降低。免疫荧光中LOC101928855主要定位于细胞核。2.正常h DPSCs中过表达LOC101928855使细胞活性降低,Raptor和成骨相关因子的基因和蛋白表达降低,细胞自噬因子基因和蛋白水平上调,细胞炎性因子的释放没有明显改变,h DPSCs成骨分化潜能下降;炎性环境下敲低LOC101928855,显著提升h DPSCs活性,炎症因子释放减少,Raptor和成骨相关因子的基因和蛋白表达显著增加,细胞自噬基因和蛋白表达下降,电镜下自噬现象显著减轻,h DPSCs成骨分化潜能增加。3.RNA-pull down,RIP和Western blot实验证明剪切因子精氨酸/丝氨1（Splicing Factor Arginine/Serinerich 1,SFRS1）蛋白能够与LOC101928855在h DPSCs中特异性结合,增强SFRS1蛋白的稳定性,过表达LOC101928855的h DPSCs中SFRS1显著性升高,功能性Raptor变体（V1、V3）显著性降低;敲减LOC101928855,SFRS1显著性降低,Raptor（V1、V3）显著性升高;过表达SFRS1抑制功能性Raptor变体（V1、V3）的表达,敲低SFRS1促进功能性Raptor变体（V1、V3）的表达;LOC101928855与SFRS1互补实验,确定了LOC101928855调控SFRS1参与Raptor变体的剪切。4.体内实验结果显示:与炎性环境下非敲减组（HA+h DPSCs+LPS组）相比,炎性环境敲减LOC101928855组（LPS+LOC101928855 sh RNA）组中碱性磷酸酶活性显著增加,新生骨量显著增加,提示后者成骨分化能力明显提高。研究结论:1.炎性环境下h DPSCs的成骨能力减弱,LOC101928855高表达,成骨因子和Raptor基因和蛋白低表达;LOC101928855主要定位于细胞核。2.慢病毒干扰下,正常状态h DPSCs过表达LOC101928855,会使细胞活性下降,Raptor和成骨相关蛋白减少,自噬水平增强;敲低LOC101928855的炎性环境h DPSCs中Raptor以及成骨相关蛋白表达增强,细胞自噬水平降低,炎性因子释放减少。3.LOC101928855作为Raptor的反义lnc RNA,通过与SFRS1蛋白特异性结合参与Raptor的pre-m RNA的可变剪切,使功能性Raptor（V1、V3）减少,增强自噬,降低干细胞的成骨分化潜能。4.羟基磷灰石支架复合炎性环境下敲低LOC101928855的h DPSCs在体内骨形成能力较未敲低的炎性h DPSCs支架复合体显著性增高。