目的阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算力损害、人格和行为改变等,多发于老年和老年前期,是最常见的痴呆类型,占所有痴呆的60～80%。关于AD的发病机制,影响较广的有“β淀粉样蛋白瀑布理论”和tau蛋白学说,然而越来越多的证据倾向于AD是一种大脑葡萄糖利用和能量产生障碍的代谢异常性疾病。这些代谢异常与AD中枢神经系统胰岛素信号通路障碍有关,其中包括了大脑中胰岛素信号的减少、胰岛素抵抗和信号通路缺陷。中枢神经系统胰岛素信号通路异常可使大脑神经元葡萄糖的摄取利用和能量产生障碍,导致代谢异常和突触可塑性损伤,进而引起认知功能的下降,从而参与AD的发展进程。因此,从中枢神经系统胰岛素信号通路入手,进一步观察神经元上葡萄糖转运体(glucose transporters, GLUTs)表达的变化,以及所导致的突触数量、神经元和形态结构改变和整体认知功能的改善情况成为我们此研究的靶点方向。课题组前期研究发现作为中药对照的姜黄素(curcumin)可以调节胰岛素信号通路和大脑葡萄糖代谢,改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的空间记忆能力,西药对照选用临床常用的第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐。半夏泻心汤甘辛苦并进,有健脾补虚、化痰清热之功,同时补泻兼施以顾其虚实,可针对AD虚实互见、脾气亏虚、痰热内蕴的病机特点。此外半夏泻心汤方中各药的主要有效成分如半夏中的鸟苷、黄芩中的黄芩苷、黄连中的小檗碱、人参中的人参皂苷以及甘草中的甘草苷均有神经保护作用。鸟嘌呤核苷,简称鸟苷(guanosine),广泛存在于多种药用植物中,也是半夏的主要成分,可依赖G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCR)介导的细胞内信号转导通路发挥神经保护作用。但半夏泻心汤和鸟苷作为干预药物是否可以通过调节胰岛素信号通路和大脑葡萄糖代谢早期发挥神经保护作用有待进一步探讨。因此,本研究旨在通过公认的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠拟AD模型,观察半夏泻心汤和鸟苷治疗3个月后对中枢胰岛素信号通路及大脑葡萄糖代谢的影响,分析半夏泻心汤和鸟苷的神经保护作用机制,寻找延缓AD病理改变和临床症状以及药物作用新靶点。材料方法1.采用3月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠75只及同窝野生型C57BL/6J小鼠15只为实验动物。将APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为模型组(等体积溶媒灌胃和腹腔注射)、西药对照组(多奈哌齐0.92mg/kg/day灌胃,等体积溶媒腹腔注射)、半夏泻心汤组(半夏泻心汤650mg/kg/day灌胃,等体积溶媒腹腔注射)、中药对照组(姜黄素200mg/kg/day灌胃,等体积溶媒腹腔注射)、鸟苷组(鸟苷16mg/kg/day腹腔注射,等体积溶媒灌胃),每组15只。于3月龄时开始对各组小鼠分别实施对应的干预治疗,连续3个月。正常组为同窝野生型C57BL/6J小鼠(等体积溶媒灌胃和腹腔注射)。2.运用Morris水迷宫和跳台实验,观察半夏泻心汤和鸟苷对6月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的学习记忆能力和记忆保持能力的影响,评价其对认知功能的改善情况。3.运用透射电子显微镜,观察半夏泻心汤和鸟苷对6月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马区的突触数量以及神经元和突触超微结构的影响。4.运用免疫组织化学和Western-blot方法,观察半夏泻心汤和鸟苷对6月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠中枢神经系统胰岛素信号通路中关键蛋白PI3K、 Akt的分布与表达水平,受此通路影响的葡萄糖代谢关键蛋白IRS2、Glut1、Glut3以及鸟苷受体GPCR的表达影响,评价其对中枢胰岛素信号通路和大脑葡萄糖代谢的调节作用。实验结果1.半夏泻心汤可以改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的空间学习记忆能力和记忆保持能力,鸟苷可以提高其记忆保持能力Morris水迷宫结果显示,随着天数的增加,各组小鼠逃避潜伏期的时间缩短,游泳距离也成递减趋势,中间有小幅波动。从第1天开始,模型组小鼠比正常组的逃避潜伏期时间明显增加(P<0.01),游泳距离也显著增长(P<0.01)。与模型组比,西药对照组小鼠第3-5天的逃避潜伏期时间缩短(P<0.05或0.01),第2-5的天游泳距离亦减少(P<0.05或0.01)。从第4天开始,中药对照和半夏泻心汤组小鼠与模型组比,逃避潜伏期时间均减少(P<0.05或0.01)。对于游泳距离而言,在第2-5天,中药对照和半夏泻心汤组小鼠均比模型组的游泳距离缩短(P<0.05或0.01),第3-5天,鸟苷组比模型组小鼠的游泳距离缩短(P<0.05或0.01)。Morris水迷宫结果显示,空间探索实验即撤台实验中,模型组小鼠目标象限停留时间显著少于正常组(P<0.01),西药对照组、中药对照组以及半夏泻心汤组小鼠的目标象限停留时间均比模型组延长(P<0.05)。跳台实验结果可以反映记忆保持情况,模型组小鼠在绝缘台上的潜伏期明显少于正常组(P<0.01)；与模型组相比,各药物干预组小鼠的潜伏期均显著增加(P<0.01)。2.半夏泻心汤和鸟苷可以增加APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马区的突触数量,半夏泻心汤可明显改善突触和神经元的结构透射电子显微镜结果显示,正常组小鼠海马区突触结构正常。模型组小鼠海马区突触结构和数量均有异常改变,突触前后膜结构不清晰,突触间隙增宽,突触内线粒体肿胀,突触数量也明显少于正常组。与模型组相比,除鸟苷组,其他3个干预组小鼠海马区突触结构基本正常；突触数量均明显多于模型组。鸟苷组小鼠海马区的突触数量多于模型组,但增加幅度不及半夏泻心汤组。除了对突触的作用外,多奈哌齐、姜黄素以及半夏泻心汤对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马区神经元的结构亦有明显改善作用。3.半夏泻心汤可以调节APPswe/PS1dE9双转基因小鼠中枢胰岛素信号通路和大脑葡萄糖代谢关键蛋白的表达,鸟苷可以提高IRS2和GLUT 3蛋白的表达量免疫组织化学染色结果显示,与正常组小鼠相比,模型组小鼠海马区PI3K、 Akt和IRS2、GLUT 1阳性细胞数明显减少(P<0.01)。多奈哌齐、姜黄素和半夏泻心汤均可以使APPswe/PS1dE9双转基因小鼠病理性降低的PI3K、 Akt和IRS2、 GLUT 1阳性细胞数显著增加(P<0.01)。与模型组比,鸟苷可以增加Akt和IRS2的阳性细胞数(P<0.01),但不能显著改变P13K和GLUT 1的阳性细胞数量。Western-blot结果发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠海马区Akt和GLUT 1、 GLUT 3蛋白含量减少(P<0.05或0.01)。多奈哌齐、姜黄素和半夏泻心汤均可以增加APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马区的Akt和GLUT1、 GLUT 3蛋自含量(P<0.05或0.01)。与模型组比,鸟苷可以增加GLUT 1和GLUT 3蛋白的含量(P<0.05或0.01),但对Akt蛋白含量的改变不显著。结论半夏泻心汤可以通过调节中枢胰岛素信号通路和大脑葡萄糖代谢中的关键蛋白PI3K、 Akt、 IRS2、 GLUT1和GLUT 3,增加海马区突触数量,改善神经元和突触的形态结构以及整体的认知功能。鸟苷能提高IRS2和GLUT 3蛋白的表达量,增加海马区突触数量并提高记忆保持能力；对PI3K蛋白的影响不显著；免疫组化和Western-blot显示其对Akt和GLUT1蛋白的调节结果相互矛盾。