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背景:骨质疏松是糖尿病在骨骼引起的慢性并发症之一,也被称为糖尿病性骨质疏松(Diabetic osteoporosis,DOP)。糖尿病患者随疾病进展出现不同程度的骨密度下降、骨微结构破坏、骨脆性增加和骨折风险增高。糖尿病引起骨质疏松的生物学基础与其导致骨形成降低而骨吸收增加密切相关,体外高糖环境可显著抑制成骨细胞介导的骨形成,最终导致机体骨量下降。目前对于糖尿病性骨质疏松的治疗以控制血糖为基础,在此之上进行抗骨质疏松治疗。然而注射胰岛素以及口服降糖药物被报道有增加糖尿病患者骨折风险的可能,抗骨质疏松药物特立帕肽也被发现可能升高患者空腹血糖。因此,对于糖尿病性骨质疏松,寻找新型、安全而有效的补充或替代治疗手段意义重大。作为一种物理治疗手段,低强度高频率机械振动(Low?magnitude high?frequency vibration,LMHFV)曾被广泛用于肌萎缩、骨质疏松和瘫痪等疾病的治疗和康复。其作为一种力学刺激手段,可以通过刺激成骨细胞增殖与分化而促进骨形成。临床资料显示在提高患者骨密度的同时,LMHFV还能增强患者肌力预防跌倒发生从而降低骨折风险。最近在糖尿病患者中,LMHFV被发现可以改善代谢降低血糖,并对糖尿病引起的周围神经痛等症状具有缓解作用。然而,对于糖尿病引起的骨密度降低、骨微结构破坏和骨脆性增加,LMHFV是否具有改善作用还未有报道。因此本研究以LMHFV作为一种潜在治疗手段,对其改善糖尿病性骨质疏松的效果进行实验研究。在此基础上,还将对LMHFV的作用机制进行探索。通过对相关实验结果的分析和比较,本研究希望明确LMHFV对糖尿病性骨质疏松是否具有改善作用及其作用机制,为其进一步临床应用提供实验依据。方法:体外实验:1、利用体外高糖环境培养的MC3T3-E1细胞构建糖尿病骨形成受抑制体外细胞模型,通过对高糖环境培养的MC3T3-E1细胞施加LMHFV构建体外LMHFV治疗模型。2、利用5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU)染色法对细胞的DNA合成情况进行检测,利用流式细胞术对细胞周期进行检测。3、利用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色和ALP活性半定量检测分析MC3T3-E1细胞早期分化情况,利用茜素红S(Alizarin Red S,ARS)染色和矿化结节生成半定量检测分析MC3T3-E1细胞晚期分化情况。4、利用RNA测序技术筛选差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)。对DEGs使用基因本体数据库(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)进行生物学功能和信号通路分析。通过将组与组之间的DEGs取交集,并结合表达量变化确定LMHFV在高糖环境下对成骨细胞产生作用的关键分子。5、利用实时荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot,WB)技术对不同实验条件下MC3T3-E1细胞出现差异的关键分子进行验证,同时对相关信号通路的变化情况进行分析。6、根据关键分子在不同实验条件下的变化趋势,构建关键分子过表达或敲减的MC3T3-E1细胞系,如高糖环境下升高而LMHFV加载后降低,则选用过表达细胞系。如高糖环境下降低而LMHFV加载后上升,则选用敲减细胞系。随后利用前面所述的检测手段,明确关键分子在高糖环境下LMHFV对成骨细胞骨形成影响中的作用。体内实验:1、利用链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导法构建糖尿病性骨质疏松大鼠模型,对出现糖尿病的大鼠施加LMHFV治疗构建体内LMHFV治疗模型。2、在LMHFV治疗过程中和结束时对大鼠体重和血糖情况进行检测。在治疗结束后,收集大鼠股骨用于后续实验检测。3、使用微焦点CT(Micro-Compute Tomography,Micro-CT)对股骨骨密度和骨微结构进行检测。4、利用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)和马松(Masson)染色法对股骨骨组织形态学进行观察。5、利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色法检测股骨骨组织中LMHFV作用关键分子和骨形成标志物骨钙素(Osteocalcin,OCN)的变化。6、利用三点弯曲实验对股骨宏观生物力学性能进行分析。7、利用拉曼光谱对股骨皮质骨骨基质组成进行分析。8、利用扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)和原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)对股骨骨干横截面微观形貌结构进行分析。结果:体外实验:1、LMHFV通过促进细胞DNA合成和细胞周期由G0/G1期向S期转变而减轻高糖环境对MC3T3-E1细胞增殖的抑制。2、LMHFV通过促进细胞ALP和矿化结节生成而改善高糖环境对MC3T3-E1细胞早、晚期分化的抑制。3、高糖环境作用和LMHFV加载后,MC3T3-E1细胞mRNA发生变化,出现DEGs。4、GO富集分析显示高糖环境引起的DEGs与成骨细胞分化的调控、成骨作用和软骨内成骨有关,而LMHFV加载后出现的DEGs与成骨作用的正向调控和成骨细胞分化的调节有关。KEGG富集分析显示LMHFV加载后出现的DEGs涉及到的信号通路中存在流体剪切力和动脉粥样硬化与Wnt信号通路。Dickkopf家族2(Dickkopf-2,Dkk2)参与流体剪切力和动脉粥样硬化与Wnt信号通路,Dkk2 mRNA表达量在高糖环境下显著增加而在LMHFV加载后显著降低,是LMHFV改善高糖环境对MC3T3-E1细胞增殖和分化抑制作用的潜在靶点。5、高糖环境导致MC3T3-E1细胞Dkk2和磷酸化-β-环联蛋白(p-β-Catenin)蛋白表达量增加,β-环联蛋白(β-Catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)和成骨细胞特异性转录因子(Osterix)蛋白表达量减少,而LMHFV加载可减弱上述效应。6、过表达Dkk2一方面通过抑制细胞DNA合成并使细胞周期由S和G2/M期向G0/G1期转变而减弱MC3T3-E1细胞增殖,另一方面通过抑制细胞ALP和矿化结节生成而减弱MC3T3-E1细胞早、晚期分化。过表达Dkk2增加了p-β-Catenin蛋白表达量,而降低β-Catenin、Cyclin D1和Osterix蛋白表达量。7、过表达Dkk2可在高糖环境下抑制LMHFV对MC3T3-E1细胞增殖和分化的促进作用,并减弱其对Dkk2和p-β-Catenin、β-Catenin、Cyclin D1和Osterix蛋白表达的影响。体内实验:1、LMHFV治疗降低糖尿病大鼠血糖,增加其体重。2、LMHFV治疗能够提高糖尿病大鼠股骨骨密度,增加骨小梁体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、皮质骨厚度和皮质骨面积,并降低骨小梁分离度。3、LMHFV治疗促进了糖尿病大鼠股骨骨小梁形态结构的恢复,增加了骨小梁骨胶原分布。4、LMHFV治疗降低糖尿病大鼠股骨骨组织Dkk2表达,并促进OCN的表达。5、LMHFV治疗增加了糖尿病大鼠股骨骨干的最大载荷和刚度。6、LMHFV治疗改变糖尿病大鼠股骨皮质骨骨基质组成,增加骨基质中矿物质比例。7、LMHFV治疗促进糖尿病大鼠股骨骨干横截面微观形貌由粗大矿物颗粒向细小矿物颗粒转变。结论:1、LMHFV可以通过促进成骨细胞增殖和分化而改善高糖环境对成骨细胞骨形成的抑制。2、LMHFV对高糖环境抑制成骨细胞骨形成的改善作用与其调节成骨细胞Dkk2表达有关。LMHFV减弱了高糖环境引起的Dkk2表达增加,并以此缓解了高糖环境对β-Catenin、Cyclin D1和Osterix的抑制从而促进了成骨细胞增殖与分化。3、LMHFV可以通过提高骨密度、改善骨微结构、提高骨生物力学性能以及调节骨基质组成改善糖尿病性骨质疏松。在体内骨组织,LMHFV同样能够降低糖尿病引起的Dkk2表达增加。