蒙药沙蓬地上部位三萜皂苷化合物的分离及生物转化研究

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沙蓬是一种广泛分布的沙漠植物,主要生长在我国北部荒漠地区,有部分报道称其含有多种的生物碱、黄酮和皂苷等生物活性物质,也是其主要药效成分,我国药典亦有沙蓬及沙蓬种子(东廧子)入药的记录。皂苷作为众多中药药材的主要药效成分,其结构中常含有大的糖基取代基团,而分子结构较大的皂苷则不利于人体的吸收利用。有研究表明结果三萜皂苷是沙蓬主要的药效成分,其结构中连接有较大的糖基,而对沙蓬有效成分的生物转化研究还并未见报道。本文对沙蓬主要有效成分三萜皂苷的进行了提取初探,并对其进行了生物转化的研究,有利于沙蓬作为经济型药用植物的开发和利用。本文采用了凯氏定氮法、考马斯亮蓝比色法、苯酚-浓硫酸显色比色法、碱水解法分别对沙蓬的总蛋含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量及脂肪含量进行了测定,对这些物质的测定有利于设计沙蓬药效成分的分离和纯化工艺;本实验还分别利用碱性条件下的Na NO2-Al(NO3)3-Na OH显色法、香草醛比色法、酸碱滴定法对沙蓬的主要药效成分即黄酮、皂苷、生物碱的具体含有量进行了测定,可为沙蓬加以扩大应开发提供参考依据。文章使用传统的乙醇提取法对沙蓬皂苷进行提取,并对提取的条件进行了优化;在大量提取后对沙蓬皂苷提取液进行浓缩除杂,并分别利用AB-8树脂柱、D280树脂柱对其进行脱糖和脱色处理。实验对采自内蒙古阿拉善沙漠地区所生长的沙蓬根部的土样进行了菌种筛选,利用初筛、复筛之后的菌种对提取到的沙蓬总皂苷进行了初步的生物转化实验并进行了薄层层析检测,并对筛选到的可对沙蓬皂苷进行生物转化的菌种加以保藏;实验还对对沙蓬有转化作用的菌种的发酵条件进行了优化,确定了其最优的培养温度、培养时间、接种量、培养基含水量和培养基配比;实验最终确定了转化沙蓬皂苷的菌种在最佳的发酵条件下得到的酶液的最优转化时间、p H和时间。实验测得沙蓬地上部分样品中的总蛋白含量为8.62%、可溶性蛋白含量0.063‰、可溶性糖含量为0.032‰、脂肪含量6.73‰;沙蓬的黄酮类化合物含量为1.07%、总皂苷含量为3.10%、生物碱含量约为5.50%。沙蓬皂苷的最佳提取条件为件为70%乙醇,65℃水浴加热2 h,过滤重复操作共提取3次;对沙蓬皂苷提取液经除杂、脱糖、脱色后得到的沙蓬皂苷微黄色的无定形粉末3.36 g,根据对沙蓬提取液皂苷的含量计算,得率为36.1%,提取到的粗皂苷经薄层层析检测在紫外光下每条带可见至少4个荧光斑点。对实验筛菌土样进行初筛、复筛后总共得到2株形态明确、菌落单一且对沙蓬皂苷有转化作用的真菌菌株,其粗酶提取液与沙蓬总皂苷进行生物转化反应后进行薄层层析检测,对照底物紫外光下均可发现荧光斑点增减或明暗变化;对沙蓬皂苷有转化作用的菌株进行发酵条件优化,最终确定菌1的最佳发酵条件为以接种量为15%(孢子含量10~7个/ml)在14:6且含水量占培养基的100%的麸皮-槐花培养基中35℃培养3 d,菌2的最佳发酵条件为以接种量为10%(孢子含量10~7个/ml)在16:4且含水量占培养基的50%的麸皮-槐花培养基中35℃培养3 d。保藏菌种以最佳发酵条件培养后以p H 5.2的醋酸-醋酸钠缓冲液处理后的培养基浸出液,用9 0 0 0 r/m i n离心处理1 0 m in保留上清液即为粗酶液,发现菌1粗酶提取液的最佳发酵条件为在p H 5.2的环境下恒温反应18 h;粗酶提取液的最佳发酵条件为在p H 5.6的环境下恒温反应24 h。
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