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核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究 研究目的 利用带有导引序列(GS)的RNase P亚单位M1RNA(M1-GS RNA)和RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)靶向作用于具有特征性靶基因BCR-ABL mRNA的慢性粒细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)细胞株K562细胞，观察它们对于靶基因及其表达产物的切割效果及细胞凋亡的变化，探索CML靶向治疗的新方法。 研究方法 1．M1-GS RNA细胞外切割实验和含M1-GS RNA模板序列真核表达载体的构建 设计BCR-ABL mRNA融合区域为GS识别靶点，以pTK117为模板(含M1RNA模板序列)通过PCR方法合成M1-GSRNA模板序列，克隆到pUC19上得到pGS210；人工合成与BCR-ABL mRNA融合位点前后序列25个碱基同源的一段DNA模板，克隆到含有T7启动子的pGEM-7zf(+)上，得到pBCR-ABL；pGS210和pBCR-ABL均经限制性酶切和测序鉴定，然后进行细胞外转录，将二者转录产物按照一定摩尔比例混合，进行细胞外核酶切割实验，利用放射自显影检测切割效率和作用的特异性；将M1-GS RNA模板序列克隆到真核表达载体pNAV-1上，得到pAVGS4，进行大量抽提、纯化。 2．检测pAVGS4转染K562细胞后不同时间BCR-ABL mRNA和p210表达的变化 以X-tremGENE Q2介导pAVGS4和pNAV-1(作为空白对照)转染K562细胞株，转染后24、48、72和96小时分别收集细胞，以Trizol法抽提总RNA，作RT-PCR(人源性β-actin作为内参照)通过半定量比较转染后不同时间BCR-ABL mRNA量的变化；收集转染后48小时和96小时实验组和对照组的细胞，抽提蛋白质，作Western Blotting，比较不同时间BCR-ABL的表达产物p210在量上的变化。 3．检测转染核酶后不同时间细胞凋亡的变化： 收集转染后24、48、72、96小时的细胞，分别应用AnnexinV-FITC+PI染色和TUNEL-FITC法通过流式细胞术检测细胞凋亡情况，比较不同时间细胞的凋亡率；收集转染后72小时实验组和对照组的细胞，通过透射电子显微镜观察法比较两组细胞形态的变化。 4．含有siRNA模板序列RNA表达载体的构建及对K562细胞的作用效应 以BCR-ABL mRNA融合区域为作用位点，根据小干扰RNA(small interfering RNA，核酶和RNA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究siRNA)模板的设计原则，设计、合成2条寡核昔酸链，退火后构建到psilencerl .0-u6上，经限制性酶切和测序鉴定，大量抽提纯化，以x一tremeGENE QZ转染K562细胞;收集转染后45和72小时的细胞，分别应用AnnexinV-FITC+pl染色和TLJNEL一FITC法通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。研究结果1.含有Ml一GS州A模板序列的pGSZ10和含有底物序列的pBCR一ABL经限制性酶切 分析和测序鉴定证实构建成功;进行细胞外转录和切割实验，通过放射自显影检测 显示:Ml一GS RNA与人工底物按照1:5的当量进行混合4小时的切割率为28.6 %，以1:1的比例混合4小时的切割率为782%，对照组抗MHC的M IRNA对于 人工底物无切割作用;构建的质粒pAVGS4经限制性酶切分析和测序鉴定证实构建 成功，大量抽提纯化后的产物浓度和纯度符合转染要求。2.在p脚GS4转染K562细胞后24、48、72和96小时，作l干卜PeR分析显示:在转 染后24小时，实验组细胞内BCR一ABL mRNA随时间的延长含量下降近1个对数 级，72和96小时时BCR-ABL mRNA的含量接近，而对照组无明显改变。W七stem Blotting分析显示:实验组在48小时的灰度是同期对照组的10.4%，%小时时为 6 .7%。3.凋亡分析:转染72小时实验组和对照组的细胞作电镜分析，在实验组见到大量凋 亡细胞，而对照组少见;应用ArmexinV十PI法检测凋亡，在转染24、48、72和% 小时的凋亡率分别为4.5%、20.1%、423%和56%(p<0.0001)，而对照组在不同时 间的凋亡率5%一6%印>0.05);通过TUNEL法检测上述时间的凋亡率实验组分别 为:5.6%、24.礴%、43.20，0和58.4%(P<0.0001)，对照组的凋亡率在6%~9%(p>0.05)。4.RNAi对于K562细胞凋亡的影响:构建含有siRNA模板的pBCR6载体经限制性酶 切分析和测序鉴定，载体内含有目标序列;经大量抽提纯化后检测pBcR6的浓度 和纯度符合转染要求;在转染48和72小时应用AnnexinV+PI染色检测凋亡率为: 25.5%和48.0%(P<0.01)，而对照组分别为6.5%和6.7%(P>0.05):应用TtJNEL法检 测2个时间的凋亡率为29.8%和53%印<0.01)，对照组为7.9%和8.9%(P>0.05)。研究结论 1.本实验己成功构建含有Ml一GS RNA模板序列的真核表达载体pAVGS4，进行 细胞外切割实验显示具有特异性切割底物的效应; 2.将pAVGS4转染K562细胞株后发现Ml一GS RNA具有特异性切割BcR一ABL mRNA作用，而且随着时间的延长切割效率增加，但72小时和96小时时作用 接近;进行PZ10蛋白检测，发现Ml一GS RNA可以有效地下调该蛋白质的表达。丛塑塑旦NA干扰靶向治疗慢性粒细胞性白血病的实验研究3.应用多种方法检测发现转染pAvGs4可以有效地诱导K562细胞凋亡，在转染 24小时后随着时间的延长，实验组的凋亡率显著增加;表明Ml一GS RNA具有