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第一部分儿童Graves病淋巴细胞亚群临床相关性分析目的:通过回顾性分析方法,研究儿童Graves病(Graves’ disease,GD)患者外周血中各淋巴细胞亚群比例与不同临床指标之间的关系,探讨不同淋巴细胞亚群在GD各临床分组中的特点及其与发病机制可能的关系。方法:选取2013年01月至2018年08月在本院内分泌科初诊未经治疗的GD患儿共133例,男童27例,女童106例,年龄2.4~15.1岁。收集的临床资料包括发病年龄、性别、体征、有无突眼、甲状腺功能及相关抗体[游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)、抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)]、肝功能[谷丙转氨酶(ALT)]、淋巴细胞亚群[CD19+CD23+、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD(16+56)+、CD3-CD19+和 CD4+/CD8+]、抗核抗体(ANA)和经治疗后血清FT4首次恢复至正常水平所需的时间。根据是否存在Graves眼病(Graves ophthalmopathy,GO),我们GD患儿分为两组:GO组(n=59)和非GO组(n=74);根据ALT水平,将患儿分为ALT异常组(男童 ALT>38U/L,女童 ALT>32U/L,n=53)和 ALT 正常组(男童 ALT≤38U/L,女童ALT≤32U/L,n=80);根据TRAb滴度水平,将GD患儿分为TRAb高滴度组(TRAb≥10U/L,n=78)和 TRAb 低滴度组(TRAb<10U/L,n=30);根据 TPOAb滴度水平,将GD患儿分为TPOAb低滴度组(0.00-60.00IU/ml,n=14)、TPOAb中滴度组(60.00-1300.00IU/ml,n=58)和 TPOAb 高滴度组(>1300IU/ml,n=61);根据ANA水平,将患儿分为ANA阳性组(n=32)与ANA阴性组(n=101);根据经ATDs治疗后血清FT4首次恢复至正常水平所需的时间,将GD患儿分为快速恢复组(T<3个月,N=78)和非快速恢复组(T>3个月,N=30)。分别计算不同组间淋巴细胞亚群的差异。结果:1.GO 组 CD3-CD19+(%)、CD4+/CD8+明显高于非GO组,CD3+CD8+(%)低于非GO组,差异均有统计学意义(p<0.05)。2.ALT异常组的CD3+CD8+(%)明显高于ALT正常组,CD4+/CD8+明显低于ALT正常组,差异有统计学意义(p<0.05)。3.TPOAb高滴度组、中滴度组和低滴度组的CD3+CD4+(%)分别是37.08±6.55、33.21±6.33和34.09±5.66,其中高滴度组水平最高,高滴度组与中滴度组之间差异有统计意义(p<0.05)。4.TRAb滴度不同,ANA是否阳性和FT4恢复时间不同与淋巴细胞亚群比例并无差异(p>0.05)。结论:1.在GD患儿中,并发GO的患儿的B细胞比例和CD4+/CD8+高于非GO患儿,而CD8+T细胞所占比例明显低于非GO患儿。2.肝功能异常GD患儿CD8+T淋巴细胞比例增多,血清ALT水平与CD8+T淋巴细胞比例相关,且此相关性不受其他因素影响。提示CD8+T淋巴细胞参与了 GD患儿肝组织损伤的免疫病理机制。3.TPOAb滴度较高的GD患儿中CD4+T淋巴细胞富集较明显,且甲功较TPO低滴度患者明显升高,推测CD4+T淋巴细胞比例失衡,可能与TPOAb高滴度患儿甲亢病情较重有关。第二部分儿童Graves病患者T细胞TCRα/β的CDR3谱系特征初探目的:采用高通量测序技术检测Graves病患儿T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)α/β 链互补决定区 3(complementarity determining region 3,CDR3)区域,探讨 GD患儿TCRα/β链CDR3区的多样性与异质性,分析在GD疾病状态下机体免疫状况和免疫细胞的变化,深入挖掘T细胞TCR的免疫组库与GD的关联,为免疫分子靶向治疗提供理论依据。方法:选取自2018年06月至2019年06月在本院内分泌科初诊的GD女童5例作为实验组,并选取5名性别和年龄相匹配的健康儿童作为对照组,两组均为6~8岁的青春期前期女童。抽取同一时间段内的肘前静脉血,分离外周血提取单个核细胞,进行培养,分离出T细胞,并提取总RNA,对TCR CDR3进行多重PCR扩增,然后对产物进行高通量测序及生物信息分析。结果:1.GD组使用频率最高三个T细胞受体α可变区(TRAV)基因为TRAV38-2/D V8、TRA V21和TRA V13-1,频率分别达到11.2%,8.7%和8.5%。这些TRAV基因虽然对照组也可检测到,但使用频率与GD组明显不同。GD组使用频率最高三个T细胞受体β可变区(TRBV)基因为TRBV5-1、TRBV20-1和TRBV12-3,频率分别达到18.0%,8.1%和6.1%,亦与对照组明显不同。2.GD组和对照组的CDR3区氨基酸长度分布基本呈正态分布,两组间相比无明显差异。3.各样本TCRα和β链CDR3区丰度差异大,GD组与对照组无明显差异。4.TCRα链共检出151417条CDR3序列,GD组平均丰度大于或等于0.001的CDR3序列共22条,这其中16条序列仅在GD组表达,而不在对照组表达。TCRβ链共检出CDR3序列171712条,GD组平均丰度大于或等于0.001的CDR3序列共20条,这其中19条序列仅在GD组表达,而不在对照组表达。结论:1.GD组与对照组相比,TCR α和β链基因使用频率明显不同,提示GD患儿存在异常的TCR组库。2.GD组与对照组相比,TCRα链和β链CDR3区氨基酸长度分布均呈正态分布,且两组间并无显著差异,因此TCR CDR3长度分布并不能用来反映GD和对照组多样性差异。3.GD组TCRα链CDR3组库共有16条高频独特氨基酸序列,TCRβ链CDR3组库共有19条高频独特氨基酸序列,对这些序列的分析及进一步研究有助于找出GD特异性TCR及其对应识别的抗原表位。