阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是中枢神经系统的进行性退行性疾病。临床表现为进行性记忆和认知障碍、言语障碍、精神运动异常等，主要病理改变是老年斑(senile plaque,SP)，神经原纤维缠结(neurofibrillaiy tangle,NFT)及神经元空泡样变等。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸，由蛋氨酸去甲基产生。Hcy可在亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)、蛋氨酸合成酶(methionine synthase,MS)的催化下，以叶酸、VitB12为辅酶再甲基化为蛋氨酸。血浆Hcy水平同时受环境因素和遗传的影响。叶酸、VitB12缺乏与血浆Hcy水平升高有关。目前的大量研究显示，高Hcy血症是心脑血管疾病的独立危险因素。1998年Clarke提出高Hcy血症与阿尔茨海默病相关，随后，国外有研究认为高Hcy血症是心脑血管疾病的独立危险因素，但目前存在很大争议。随着免疫学和分子生物学的发展，研究者发现AD脑中存在着大量炎性因子如IL-1、IL6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、趋化因子、转化生长因子以及补体等，这些因子是由激活的小胶质细胞和星形胶质细胞产生的，通过刺激这些细胞的活性，发生局部的免疫反应而增加β淀粉样肽的产生。TNF-α基因位于染色体6p21.3，全长约为3kb,由4个外显子和3个内含子组成，广泛参与免疫系统的发育、炎症反应和免疫调节等。TNF-α具有双重、多样及网络性生物效应.不仅参与维持正常生理功能.还可在多种病理过程中异常表达并具重要作用。有研究证实TNF-α基因启动子区域-238G/A、-308位点存在多态性，这种基因多态性的存在可能影响TNF基因转录和表达，进而影响TNF的生物学功能。实验动物及人体研究表明TNF参与调控正常和异常的脑发育，因此，深入了解炎性因子TNF及其遗传多态性在AD慢性炎症病理改变中作用，对进一步阐明AD的分子及遗传发病机制并指导治疗有重要意义。本文旨在通过了解AD患者血浆Hcy水平及给予AD患者服用叶酸、VitB12，探讨叶酸、VitB12对AD患者血浆Hcy水平的影响；利用聚合酶链式反应(PCR)技术检测对AD和对照者的TNFα-238G/A、-308 G/A基因和血清TNF水平进行检测，初步探讨TNFα-238G/A、-308G/A基因多态性及其与Alzheimer病的关系。　　 第一部分、维生素干预治疗对Alzheimer病患者血浆同型半胱氨酸水平的影响　　 材料与方法：　　 1.研究对象：所有研究对象为2005年1月～2006年8月广州市老人院痴呆病区及广州医学院第二附属医院神经内科收治的AD患者，为汉族人，年龄≥60岁，各研究对象无血缘关系。AD组75例，符合美国神经病学、语言障碍和卒中—老年性痴呆和相关疾病学会(NINCDS—ADRDA)诊断AD标准中“很可能AD"，根据临床痴呆量表(clinical dementia rating scale,CDR)评分分组，分为轻中度AD和重度AD；对照组71例，无痴呆及神经系统变性病，性别、年龄、合并症与AD组相匹配。所有研究对象4月内无脑梗塞及心肌梗死发作，均除外恶性肿瘤、肝肾功能不全、甲状腺疾病、严重营养不良等疾病及排除近1个月内服用影响Hcy水平的药物(如：避孕药、抗癫痫药物、多巴胺类药物、叶酸、VitB12等)者。　　 2.收集血标本：抽取研究对象清晨空腹静脉血3ml，置于含有2％乙二胺四乙酸二钠(EDTA)100μl的一次性试管中，保存于4℃冰箱，1h内离心(3000rpm，10min)，分离出血细胞、血浆，-20℃冰箱保存。　　 3.血浆Hcy、叶酸、VitB12浓度测定：取-20℃冰箱保存血浆，用荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunassay，FPIA)检测血浆Hcy浓度，用微粒子酶免分析法(microparticle enzyme immunoassay，MELA)测定血浆叶酸、VitB12浓度。　　 3.叶酸、VitB12干预治疗：随机选取32例AD接受8周维生素干预治疗，给予口服叶酸5mg及VitB12500,每日1次，在治疗4周、8周时复查血浆Hcy、叶酸、VitB12浓度。　　 4.统计学分析：所获的计数指标用SPSS11.5统计软件分析，以P＜0.05为判断差异有统计学意义。　　 结果：　　 1.AD组和对照组血浆Hcy、叶酸、VitB12水平比较　　 AD组血浆Hcy水平显著高于对照组(P＜0.001)，血浆叶酸、VitB12显著低于对照组(均P＜0.001)。相关分析显示：AD患者血浆Hcy、叶酸、VitB12水平呈负相关(r1=-0.237，P=0.041,r2=-0.356，P=0.002)。　　 2.重度AD患者血浆Hcy水平明显高于轻中度AD患者(P＜0.05)，血浆叶酸水平低于轻中度AD患者(P＜0.05)。　　 3.叶酸、VitB12干预治疗对AD患者血浆Hcy浓度的影响　　 32例AD患者接受了叶酸、VitB12干预治疗，结果发现：血浆Hcy水平下降与治疗时间相关，服用维生素干预治疗8周后，血浆Hcy明显下降(t=11.601,P＜0.001)；叶酸和VitB12则显著升高(t1=-10.46，P＜0.001；t2=-5.352，P＜0.001)。　　 结论：　　 1.AD患者存在血浆Hcy水平升高及叶酸、VitB12水平降低，AD患者血浆Hcy水平与叶酸、VitB12水平呈负相关。　　 2.AD患者血浆Hcy水平与痴呆程度相关，痴呆程度越严重，血浆Hcy水平越高。　　 3.口服常规剂量叶酸、VitB12可明显降低AD患者血浆Hcy水平。　　 第二部分、Alzheimer病患者与肿瘤坏死因子308G/A、238G/A基因多态性的关系　　 材料与方法：　　 1.研究对象：均为2006年7月-2007年10月广州市老人院AD病人，与广东地区汉族人饮食结构相似，各研究对象之间无血缘关系，两组间性别和年龄差异无显著意义。AD组66例，男34例，女32例，平均年龄(75.462±9.125)岁。全部病例应用简易精神状态检查量表(mini-mental state examination，MMSE)日常生活活动能力量表(activities ofdaily living,ADL)初筛出存在痴呆，Hachinski缺血指数分＜4分排除缺血性痴呆，哈密尔顿抑郁量表(HAMD)评分＜8分排除抑郁状态。根据美国神经病学、语言障碍和卒中-老年性痴呆和相关疾病学会NINCDS-ADRDA的临床诊断标准诊断为临床很可能AD。对照组143例，男75例，女68例，平均年龄(72.259±8.014)岁。全部为生活在广州老人院的智能正常老年人，纳入标准：(1)无严重脑血管病及其他神经系统疾病；(2)简易精神状态检查量表(MMSE)分值均高于与文化程度相对应的分界值。　　 2.人外周血白细胞DNA的提取：静脉血2ml，EDTA抗凝，采用美国Gentra公司的DNA抽提试剂盒，抽提基因组DNA。　　 3.TNFα-308 G/A基因多态性的检测：参照文献设计引物，PCR扩增TNFα-308G/A基因后的产物长度为116bp，产物用NcoI限制性内切酶酶切，用3.5％琼脂糖凝胶电泳后，观察酶切后的产物长度。　　 4.TNFα-238G/A基因多态性的检测：参照文献设计引物，PCR扩增TNFα-238G/A基因后的产物长度为152bp，产物用MspⅠ限制性内切酶酶切，用3％的琼脂糖凝胶电泳后，观察酶切后的产物长度。　　 5.血浆TNF水平测定：取静脉血2ml，注入含10％依地酸二纳(EDTA)30μl，在4℃下离心10 min，取血浆置-20℃保存至同批测定。酶免法测量血浆TNFα水平。　　 6.统计学分析：用SPSS11.5统计软件进行分析，计算上述基因的基因突变率、等位基因频率、基因型频率、基因多态性与疾病的相关性及相对危险度。计量资料组间比较用独立样本t检验、配对t检验和单因素方差分析，计数资料组间比较用x2检验。基因型及等位基因相对风险率比数比(Odds Ratios，OR)以及95％可信区间表示，显著水平用x2检验，及Logistic回归分析确定独立危险因素。　　 结果：　　 1.血浆中TNF水平，AD组明显高于对照组，两组之间比较差异有统计学意义。　　 2.AD组与对照组之间TNFα-308G→A突变差异无统计学意义;AD与对照组TNFα-308G→A基因三种基因型携带者组间血浆TNF水平比较差异也无统计学意义。　　 3.AD组与正常对照组之间TNFα-238G/A突变差异无统计学意义；AD与对照组TNFα-238G/A基因三种基因型携带者组间血浆TNF水平比较差异也无统计学意义。　　 4.TNFα-308G/A和TNFα-238G/A的复合基因型在AD和对照组之间无统计学意义。　　 结论：　　 AD组血清TNF水平显著升高，提示炎性反应在Alzheimer病程中有重要作用，TNFα-308G/A和TNFα-238G/A等位基因的出现不能被用来作为区分AD和健康对照人群的标识。