【摘 要】
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吴茱萸是指芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实,为我国传统中药,具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效,为肠康片、香连片、左金片、戊己片,吴茱萸汤等多种中药制剂的原料。吴茱萸应用历史悠久,且药效作用广泛,其有效成分主要为吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素及挥发油成分。当前,吴茱萸的研究多集中于栽培技术、药理药效及有效成分的研究,而有效成分生物合成途径及其合成关键酶研究较少。本实验围绕不同
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吴茱萸是指芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实,为我国传统中药,具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效,为肠康片、香连片、左金片、戊己片,吴茱萸汤等多种中药制剂的原料。吴茱萸应用历史悠久,且药效作用广泛,其有效成分主要为吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素及挥发油成分。当前,吴茱萸的研究多集中于栽培技术、药理药效及有效成分的研究,而有效成分生物合成途径及其合成关键酶研究较少。本实验围绕不同时期吴茱萸,通过高效液相色谱（HPLC）技术及气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术测定了其有效成分的含量变化,再利用PacBio Sequel高通量测序仪对不同时期吴茱萸果实进行了全长转录组及表达谱的测序,获得了大量的吴茱萸转录本信息和基因的时空表达规律,基于“化学含量+全长转录组+基因表达谱”共表达模式筛选出了参与吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、挥发性成分等生物合成途径的候选关键酶基因,为吴茱萸此类有效成分生物合成途径的阐明奠定了基础,同时为后续通过转基因、合成生物学、发酵工程等手段实现吴茱萸有效成分的生物制造及分子育种提供了可能。主要研究成果如下:1.不同时期吴茱萸有效成分含量变化趋势对6个时期吴茱萸进行了 HPLC及GC-MS检测,获得了吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、月桂烯、芳樟醇及（Z）-罗勒烯等6种关键有效成分的含量变化规律。其中吴茱萸碱与吴茱萸次碱含量变化趋势几乎一致,在前5个时期一直处于上升状态,仅在最后1个阶段有一个短暂的下降;柠檬苦素含量变化则是一直处于下降状态;月桂烯、芳樟醇及（Z）-罗勒烯三种物质在六个时期的含量变化较为复杂且皆不相同,但整体含量变化差异较小。综合考虑吴茱萸有效成分累积规律、生长特性及生产采收要求,筛选出4个时期进行高通量测序。2.吴茱萸全长转录组测序和生物信息学分析4个时期吴茱萸混样进行全长转录组测序,获得了 73 Gb的原始数据,经过聚类及校正后得到63744条一致性序列,高质量序列序列达到63550条,达到了 99.7%,去冗余后最终获得19044条Unigene。与各数据库进行比对后,有18704条Unigene被注释,总注释率为98.21%,其中在NR数据库中注释最多,达到18662条,注释最少的为KEGG数据库,仅有5943条。对上述成分的生物合成相关基因进行分析,发现了月桂烯、罗勒烯及芳樟醇等挥发性萜类成分53条候选基因;柠檬苦素生物合成途径发现2条候选基因（不含MVA及MEP途径）;吴茱萸碱、吴茱萸次碱生物合成途径发现了53条候选基因,共计108条基因。3.不同时期吴茱萸表达谱（RNA-seq）测序及生物信息学分析4个时期的吴茱萸单独采用RNA-seq进行表达谱测序,每个表达谱均获得了69446626-93598438条不等reads,与全长转录组的基因注释率达到了 70.53%-73.40%。通过差异分析,发现WZY6与WZY1差异基因最多,达到了 11996条;最少的为WZY4与WZY3之间,只有5943条差异基因。4.吴茱萸有效成分生物合成关键酶基因的筛选基于“化学含量+全长转录组+基因表达谱”共表达模式从108条候选基因中筛选出了 29条可能参与上述6类成分的生物合成,其中筛选出（Z）-罗勒烯生物合成关键酶基因8条;芳樟醇生物合成关键酶基因6条;月桂烯生物合成关键酶基因5条;柠檬苦素生物合成关键酶基因5条（含MVA及MEP途径）;吴茱萸碱与吴茱萸次碱生物合成关键酶基因5条。
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