由于目前外科手术、放疗、化疗等传统肿瘤治疗方式的局限性日渐显露,研究者们迫切需要探求新型且高效的肿瘤诊疗方式以应对威胁人类健康及生命的肿瘤疾病。超声（Ultrasound,US）作为一种真正意义上的无创技术已被用于临床肿瘤治疗。其中,低强度聚焦超声（Low Intensity Focused Ultrasound,LIFU）可以增加肿瘤血管通透性,提高抗肿瘤药物在肿瘤部位的富集量,还能够激活某些药物产生细胞毒性,从而增强治疗效果;高强度聚焦超声（High Intensity Focused Ultrasound,HIFU）通过超声的机械效应、热效应和空化效应使靶区组织产生不可逆的凝固性坏死,从而有效杀死肿瘤细胞,具有安全性高、操作简便及副作用低等优点。此外,随着纳米技术的快速兴起,具有复合功能的纳米材料由于其优异的特性已逐渐在肿瘤诊治方面显示出极大的应用潜力。一方面,纳米材料可以克服体内复杂的生理屏障对药物靶向输送效率的影响;另一方面,纳米材料可实现肿瘤的显像,在肿瘤的精准诊断和早期治疗方面具有重要的意义。将超声与纳米技术相结合,可实现有效的协同作用,从而增强肿瘤的治疗效果。为了实现药物的肿瘤特异性递送及有效的抗肿瘤效果,改善目前肿瘤治疗方式的局限性,我们设计并构建了一种结构稳定、肿瘤微环境刺激响应型的纳米材料用于递送药物（Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP）,并探讨其联合超声在肿瘤诊疗中的应用。主要研究内容如下:目的开发具有结构稳定性、良好生物相容性的肿瘤微环境响应型纳米系统,探究其联合超声的体内外抗肿瘤活性作用,实现多种联合治疗策略高效抑制肿瘤,以期为纳米系统和超声的发展提供新的契机。方法1.Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP的制备及表征:采用氧化还原法制备片层结构的超薄二氧化锰纳米层,通过其对声敏剂二氢卟吩e6（Ce6）的吸附得到Ce6-MnO₂纳米复合体。为了增加Ce6-MnO₂的稳定性,将其包载于经酯化反应得到的聚乙二醇-双硒（PEG-HBSe）中,利用可见光诱导的双硒键交联法得到核交联纳米粒,并在表面修饰pH敏感细胞穿膜肽（HE-CPP）,最终得到具有主动靶向能力的肿瘤微环境响应型Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP纳米粒。对其形貌、粒径、电位、体外稳定性、释药行为及溶血率等进行考察。2.Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP体外抗肿瘤活性的研究:通过激光共聚焦及流式细胞术检测纳米粒在MDA-MB-231细胞中的摄取和分布,并验证该纳米粒产生ROS的能力;采用CCK-8法分别验证纳米材料及纳米粒对细胞的毒性作用并通过凋亡实验检测细胞的凋亡情况。3.Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP药代动力学及多模态成像的研究:通过检测不同时间点血液中药物浓度以评估纳米粒的药物代谢动力学;利用活体成像验证纳米粒的靶向功能及裸鼠体内的生物分布情况;观察Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP于体内外对光声及核磁成像效果的影响。4.Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP体内抗肿瘤活性的研究:以荷MDA-MB-231瘤的雌性裸鼠为动物模型,对纳米粒在肿瘤部位产生ROS的水平进行考察,并通过观察瘤鼠相对肿瘤体积变化、体重变化和生存曲线以及肿瘤切片病理学检测来评估纳米粒的抑瘤效果和生物安全性;经尾静脉注射纳米粒后1 d、7 d、14 d及28 d收集血样行血常规、血生化分析进一步考察纳米粒生物安全性。5.Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP增效HIFU治疗的研究:通过肿瘤HIF-1α免疫荧光和肿瘤部位血氧饱和度测定验证纳米粒生成氧气及改善瘤内乏氧状态的能力;通过体内外实验评估纳米粒用于HIFU增效的可行性及安全性。结果1.成功制备的Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP多功能纳米粒具有较高载药率（8.90%）和合适粒径（175.8±7.2 nm）,该纳米粒在生理环境中显示出良好的稳定性,同时纳米粒中的MnO₂纳米层还具有pH/GSH刺激响应控释的能力,在48 h时累积释放量达到85.4%;与红细胞共孵育后未引起溶血现象,具有良好的生物相容性。2.细胞实验表明,Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP纳米粒可有效进入细胞,在超声作用下生成活性氧物质（ROS）;比之单一的声敏剂Ce6,Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP在超声的作用下细胞抑制率高达93.48%,呈现出良好的剂量依赖性,具有更高的抗肿瘤疗效,而纳米载体对细胞无显著毒性;Annexin-V FITC/PI和CAM/PI双染法证明该纳米粒通过诱导细胞凋亡途径来抑制细胞增殖。3.核交联策略为Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP纳米粒提供了长效的血液循环时间,使得体内的半衰期是游离Ce6的2.02倍,同时防止药物的过早泄漏;体内活体成像实验评价,该纳米粒可以高效靶向肿瘤,增加其在肿瘤靶区的累积,在注射8 h后荧光强度达到峰值,48 h肿瘤部位仍可见较强的荧光信号;经尾静脉给药24 h后肿瘤靶区的药物累积浓度约为游离Ce6的7.5倍;该纳米粒还表现出显著增强的光声信号和MRI信号,具有用于多模态成像的潜力。4.体内抗肿瘤活性实验中,通过对比游离Ce6和Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP纳米粒在超声的激活下产生ROS的水平,证明了MnO₂具有提高乏氧环境中声敏剂对肿瘤细胞毒性作用的特性;在MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型中,该纳米粒对肿瘤的抑制作用显著强于其他处理组,其肿瘤增殖速度最慢、肿瘤体积变化最小;小鼠体重和血常规、血生化指标无明显变化。5.HIF-1α免疫荧光切片和血氧饱和度检测结果显示Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP可在肿瘤部位降解并原位生成氧气,改善肿瘤乏氧环境;体外离体牛肝模型中,HIFU辐照功率为150 W,辐照时间5 s时即可达到最佳的消融效果;体内瘤鼠动物模型中,Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP组经HIFU消融后的灰度值明显高于单纯HIFU治疗组,凝固性坏死明显,且能效因子较单纯HIFU组低,差异具有统计学意义（P<0.05）;H&E病理组织切片观察,纳米粒组HIFU消融后凝固性坏死区域与正常组织分界明显,消融区细胞形态结构消失。结论在本论文中,成功构建了一类具有主动靶向能力的肿瘤微环境响应型Ce6-MnO₂/CCNP-HE-CPP纳米粒用于递送声敏剂到达肿瘤部位,实现多种治疗方式的协同作用。通过核交联的方法克服了由于纳米载体结构不稳定导致的药物过早释放,实现了纳米载体对肿瘤微环境刺激响应性药物控释,同时增强药物在肿瘤部位的富集。为改善传统抗肿瘤方式的局限性、克服现有纳米载体稳定性不足以及解决HIFU增效剂目前存在的问题提供了新思路。