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高速蓬勃发展的前沿基因疗法迫切需求高效低毒的递送平台,因此可用于传输基因编辑工具的递送载体成为当前研究的热点。本文以开发用于CRISPR/Cas9基因编辑技术的非病毒载体为研究课题,构建了 CRISPR All-In-One表达质粒作为样板基因编辑系统模型,制备了改性壳聚糖类材料,探讨了以壳聚糖类材料作为非病毒类载体递送CRISPR/Cas9基因编辑工具的可行性。基因疗法是一种从遗传物质层面处理疑难重症的新兴治疗策略。在基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因治疗中,可通过构建共载sgRNA及Cas9蛋白的All-In-One表达质粒实现对目标基因的靶向处理。众多研究表明ApoE基因是一个极具发展潜力的基因治疗靶点,因此本研究通过基因重组技术构建了以其为靶标的CRISPR All-In-One表达质粒作为完整基因编辑系统模型。测序结果确认重组基因编辑质粒构建成功,紫外分光光度计检测结果证明提取质粒浓度高、纯度好。壳聚糖是一种天然带正电的线性多聚物,具有基因负载能力强、生物相容性高、细胞毒性低、易于修饰改性等诸多优点,作为非病毒类载体材料备受关注。但其水不溶性及低转染效率使其应用极大受限,对其进行季铵化改性可提高水溶性。本研究通过一步法制备了 N,N,N-三甲基化壳聚糖(N,N,N-Trimethyl chitosan,TMC),并经核磁共振波谱分析及傅立叶红外透射光谱分析鉴定确认实现季铵化。通过静电络合分别以壳聚糖及TMC作为载体自组装结合CRISPR All-In-One表达质粒制备了载基因纳米复合物。通过琼脂糖凝胶电泳、动态光散射分析等方式分别考察了各纳米复合物的凝胶阻滞情况、平均粒径、粒径分布及Zeta电位等指标。通过控制单因素变量考察,对制备工艺加以优化。实验结果证明壳聚糖类材料可以通过静电吸附有效结合并压缩CRISPR All-In-One表达质粒。较优条件下制备的纳米复合物样品平均粒径均小于200 nm,PDI<0.3,且表面都带正电荷。选用HEK-293T人胚胎肾细胞对壳聚糖类材料载CRISPR All-In-One表达质粒纳米复合物的基因递送能力及生物安全性进行了体外评价。转染实验结果表明壳聚糖类材料可以有效传递外源性CRISPR All-In-One表达质粒进入细胞,其中TMC递送组相较壳聚糖递送组转染效率更高。MTT实验结果显示壳聚糖类材料载CRISPR复合物在各实验浓度下均对细胞生存活力无显著影响,生物安全性高。