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背景:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要类型,其发病率高,预后差,这与HCC的发病机制不明有关。肝硬化对肝癌发生有重要的促进作用,但是这一作用的分子机制仍不清楚。近年来,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在多种疾病发生发展中有重要功能已被阐明。研究肝硬化相关lncRNA在肝癌中的作用有助于阐明肝癌发生发展机制。目的:1.高通量筛选在伴与不伴肝硬化的肝癌中差异表达的lncRNA并通过实验探索其作用。2.明确lncRNA DERCNC与基因SOX9表达的相关性及SOX9在lncRNA促肝癌增殖中的作用。3.明确DERCNC调控SOX9的分子机制。4.明确DERCNC表达与临床特征的相关性及其对预后的提示意义。方法:第一部分:肝硬化相关lncRNA的筛选及lncRNA DERCNC的表达和功能研究1.伴与不伴肝硬化的肝癌差异表达的lncRNA和mRNA生物信息学分析。2.差异lncRNA筛选、lncRNA DERCNC编码能力及物种保守性分析。3.核浆分离确定DERCNC的亚细胞定位。4.FISH实验验证DERCNC的亚细胞定位。5.DERCNC在伴与不伴肝硬化的肝癌中的表达差异验证,及其在各肝癌细胞系中的表达分析。6.在高表达DERCNC的细胞系中,评估DERCNC沉默对肝癌细胞增殖和迁移的影响。7.在低表达DERCNC的细胞系中,评估DERCNC过表达对肝癌细胞增殖和迁移的影响。8.检测DERCNC过表达在动物体内环境中对肝癌细胞增殖的作用。第二部分:lncRNA DERCNC与SOX9表达的相关性及SOX9在lncRNA DERCNC促肝癌增殖中的作用研究1.在高表达DERCNC的肝癌细胞系中使用ASO沉默DERCNC或在低表达DERCNC的肝癌细胞系中使用慢病毒载体技术过表达DERCNC,qRT-PCR和Western blot检测DERCNC沉默和过表达后对SOX9 mRNA和蛋白水平的影响。2.DERCNC和SOX9蛋白的定位检测。3.检测DERCNC与SOX9在肝癌、癌旁和正常肝组织的表达相关性。4.在肝癌细胞系中干扰SOX9后用CCK-8检测SOX9沉默对细胞增殖的影响。5.在过表达DERCNC后的肝癌细胞系中,对SOX9进行沉默,通过CCK-8检测细胞增殖情况,以评估SOX9在DERCNC促进肝癌增殖中的作用。第三部分:lncRNA DERCNC调控SOX9的分子机制研究1.分析SOX9基因启动子区域的表观遗传修饰情况。2.使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理细胞后,检测乙酰化修饰对SOX9表达的影响。3.在肝癌细胞系中过表达DERCNC后,使用ChIP实验检测SOX9启动子区的H3K27ac修饰情况,评价DERCNC对SOX9启动子区组蛋白修饰的影响。4.提取DERCNC过表达、沉默和阴性对照细胞系的总蛋白,Western blot检测SOX9下游调控通路的关键蛋白,以评估DERCNC调控增殖的所涉及的信号通路。第四部分:DERCNC在肝癌组织中的表达、临床相关性以及与预后的关系1.检测DERCNC在组织芯片中的表达情况。2.分析DERCNC与临床特征的相关性。3.评估DERCNC在肝癌预后评估中的意义。结果:第一部分:肝硬化相关lncRNA筛选及lncRNA DERCNC的表达和功能研究1.基因芯片发现伴与不伴肝硬化的肝癌有lncRNA和mRNA的表达差异,并且这些差异基因与重要的生物学过程和通路相关。2.按照筛选流程,本研究确定了下一步要研究的lncRNA DERCNC,该lncRNA没有编码能力,其在常见物种中的保守性较差。3.核浆分离结果提示DERCNC定位于细胞核。4.FISH实验证实DERCNC定位于细胞核。5.扩大样本量验证发现,DERCNC在伴肝硬化的肝癌中表达比不伴肝硬化的肝癌更高,其在肝癌细胞系中表达也比正常肝细胞系中更高。6.体外DERCNC沉默抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力。7.体外DERCNC过表达促进肝癌细胞的增殖和迁移能力。8.在裸鼠皮下成瘤实验中,肝癌细胞DERCNC过表达促进肝癌增殖。第二部分:lncRNA DERCNC与SOX9表达的相关性及SOX9在lncRNA促肝癌增殖中的作用研究1.DERCNC沉默能够抑制SOX9的RNA和蛋白水平的表达;DERCNC过表达能够促进SOX9的RNA表达水平。2.lncRNA DERCNC和SOX9蛋白共同定位于细胞核。3.DERCNC和SOX9在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中表达均呈正相关。4.CCK-8实验证实,SOX9沉默能够抑制肝癌细胞增殖。5.DERCNC过表达对肝癌细胞增殖的促进作用能够被SOX9沉默所削弱,SOX9的表达在DERCNC促肝癌增殖中有重要的作用。第三部分:lncRNA DERCNC调控SOX9的分子机制研究1.在SOX9启动子区域存在较高的H3K27乙酰化修饰,提示SOX9的表达可能受到组蛋白乙酰化的修饰。2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA能够诱导肝癌细胞中SOX9基因的表达,表明组蛋白乙酰化修饰可以调控SOX9基因表达。3.DERCNC过表达能够促进SOX9基因启动子区域的H3K27乙酰化。4.DERCNC的表达异常可能通过介导SOX9基因的改变,从而影响TGF-β信号通路、Erk1/Erk2信号通路和Wnt/β-catenin信号通路的改变,但对Notch信号通路则无影响。第四部分:DERCNC在肝癌组织中的表达、临床相关性以及与预后的关系1.肝癌组织芯片的FISH染色结果提示,DERCNC在肝癌中表达较配对的癌旁组织中表达更高。2.DERCNC表达与肝癌患者的年龄呈负相关,而与肝硬化为正相关的关系。3.DERCNC高表达患者术后生存时间较低表达患者生存时间更短。结论:伴与不伴肝硬化的肝癌有许多差异表达的lncRNA和mRNA,生物学分析初步揭示了这些lncRNA和mRNA在肝癌中的作用。差异表达谱分析让我们得到了一个之前未被研究过的肝硬化相关的lncRNA DERCNC。后续分析表明,DERCNC定位于细胞核。我们收集的临床数据联合公共数据库的数据分析,均证实DERCNC在肝癌中的异常高表达,并且有着重要的预后指示意义。体内外实验表明,DERCNC可以促进肝癌的增殖和迁移。在机制方面,DERCNC能够通过介导SOX9基因启动子区的H3K27乙酰化修饰,促进SOX9的表达,以调控肝癌进展。