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抑癌基因和原癌基因通过表观遗传学和遗传学机制上的异常导致了急性白血病的发生。多种抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化导致的相应基因沉默,在急性白血病发生发展中起了重要的作用,并成为急性白血病细胞的特征之一。DNA结合抑制因子4（Inhibitor of DNA binding 4,ID4）属于螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix,HLH）蛋白家族,导师于力教授通过甲基化敏感性限制性路标基因组扫描技术（Restriction Landmark Genomic Scanning,RLGS）筛选出ID4基因,并首次发现它是一个受甲基化调控的抑癌基因。进一步通过甲基化特异性PCR（MS-PCR）技术研究发现,ID4甲基化的发生与急性白血病病情的发展密切相关。这些研究结果提示:ID4基因启动子区甲基化可能成为急性白血病的一种新的生物标记。目前针对ID4甲基化的研究仍然停留在定性水平,将实时定量PCR技术与MSP技术结合,分析急性白血病病情的发展与ID4基因甲基化量化水平之间的关系,这一课题在国内外尚属于研究空白。ID4甲基化特异性定量PCR方法的建立从理论上可以提高甲基化检测水平的特异性和敏感性,在微小残留病变检测、复发风险评估、治疗策略选择等方面具有重要的临床意义。本研究建立了ID4甲基化特异性定量PCR方法,并通过对急性白血病患者肿瘤负荷与甲基化水平之间的变化趋势分析探讨该方法在在微小残留病变检测、复发风险评估中的意义。首先实验通过MSP和定量MSP的方法在细胞系中证明:1、HL-60、U937、MOLT4、NK-92血液肿瘤细胞系为ID4基因高甲基化细胞系。K562甲基化阳性,甲基化程度低于前四种细胞系。293-t、293细胞系的ID4基因启动子区呈非甲基化状态。2、在ID4基因启动子区在急性白血病淋系和髓系细胞系中甲基化均为阳性,提示可能在急性白血病亚型中ID4甲基化覆盖率较广。3、定量MS-PCR结果与MS-PCR结果一致,证明在定量MS-PCR体系的可靠性。第二,建立完整的ID4甲基化定量PCR体系,包括设计ID4甲基化特性探针、引物;选择内参体系、阳性、阴性以及空白对照;成功构建了目标片段和内参扩增片段的质粒;制作目标片段和内参的标准曲线;选择适合的定量分析方法。并验证该方法的特异性和敏感性,结果证明:1、17例正常骨髓ID4甲基化均为阴性,45例初治急性白血病骨髓样本甲基化阳性率为77.8%,其中AML为72.7%,ALL为79.2%,方法具有良好的特异性。2、将甲基化阴性和阳性细胞系按不同比例混合,该方法最低可以检测到1:10-5中的ID4甲基化阳性细胞,证明敏感性高。第三,在方法建立的基础上,初步尝试检测急性白血病骨髓样本:1、甲基化阳性率中,正常骨髓标本均为0,初治组为75%,复发、未缓解组为100%。结果提示:在急性白血病细胞中耐药、难治的克隆甲基化阳性率高;易复发、难治的亚型甲基化阳性率呈增高的趋势。2、PMR（percentage of methylatedreference）值代表甲基化定量水平,正常组均为0与患病组有显著差异（p＜0.00）;在不同疾病状态下（初治、完全缓解、复发、未缓解）初治组与完全缓解组PMR值有统计学差异（p=0.031＜0.05）。PMR值似乎与肿瘤在体内的负荷有关。初治时个体间PMR值差异较大。3、系列样本的研究发现:持续缓解状态时,PMR值一直保持在极低的水平;复发时PMR伴随肿瘤细胞数量增加而增加,PMR值与急性白血病肿瘤负荷有显著的相关性;有提前预测形态学复发的可能;与其他遗传学微残指标变化趋势相同,可检测到急性白血病分子复发。总之,本研究成功建立了ID4甲基化特异性定量PCR的体系和方法。同时通过临床样本证明:ID4基因启动子区的甲基化在各急性白血病亚型中具有覆盖率广;该方法特异性好,敏感性高;甲基化水平的量化指标PMR值,可以反映急性白血病患者肿瘤细胞负荷变化;不同克隆的白血病细胞间存在差异;动态监测具有提示复发的作用,具备成为新的MRD检测标志的潜质。本研究为其在MRD检测中的应用奠定了初步的实验基础。